用于检测宫颈癌的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供用于检测宫颈癌的试剂盒及其应用，本发明专利技术的试剂盒是基于等温扩增方法和CRISPR/Cas方法结合直接检测宫颈癌的POCT试剂盒，所述试剂盒是检测SEPT9基因启动子SEPT9:77373475

【技术实现步骤摘要】
用于检测宫颈癌的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及一种于检测宫颈癌的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，在肿瘤的发生和发展中起着重要的调控作用。因此，差异表达的甲基化DNA是肿瘤早期诊断和预后监测的重要生物标记物。亚硫酸盐依赖的检测方法(BS)是临床上核酸基因甲基化检测的金标准。这种方法是DNA经亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶(C)被转化成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶保持不变。处理后的DNA通过测序或使用特异性引物PCR得到非常准确的DNA序列甲基化位点信息。但是其操作步骤繁琐、耗时时间长、实验条件严苛，加上靶基因易降解、转化不完全且回收率低，这些固有的缺点导致结果基因甲基化(尤其是丰度极低的基因)检测结果分析不准确和结果重复性较差，严重限制了其在临床检测效果。
[0003]而甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)刚好可以克服BS的缺点，这种方法是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区域不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行后续分析。由于其反应条件较为温和，可以极大的避免了DNA的降解。此外，与BS需要产物回收和纯化相比，MSRE反应的酶切产物通常不需要纯化即可进行后续的检测反应。但是此检测方法通常检测灵敏度比较低，需要产物的进一步扩增，即需要昂贵的PCR仪。PCR是使用最为广泛的核酸扩增技术，以其灵敏性、特异性得到广泛应用，然而PCR需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。
[0004]自20世纪90年代初，很多实验室开始发展无需热变性的恒温扩增技术，现已开发出重组聚合酶扩增技术(RPA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、链替代等温扩增技术(SDA)、滚环等温扩增技术(RCA)等温扩增技术等技术。其中，如SDA、RCA和RPA已经成功的用于甲基化基因的检测。SDA和RCA是一个耗时较长的实验，需要数小时才能使目的产物达到峰值，导致其在甲基化检测中灵敏度较低。然而RPA能够在半小时内使目的产物扩增量达到峰值且具有极高的准确度，因此被广泛用于疾病检测中。
[0005]近年来，基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)技术的核酸检测如SHERLOCK、DETECTR，因其快速又灵敏的特性备受关注。在先前的研究中，CRISPR/Cas12b结合BS技术(称为HOLMESv2)已经被用于DNA甲基化检测中。然而，HOLMESv2检测过程复杂限制了其在临床上的应用。因此，开发快速、灵敏、简单易用的甲基化基因检测技术，对于临床上疾病检测显得非常重要。

技术实现思路

[0006]为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于检测宫颈癌的试剂盒，所述试剂盒包括
检测SEPT9基因启动子SEPT9:77373475
‑
77373595的甲基化试剂。
[0007]本专利技术提供一种基于等温扩增方法和CRISPR/Cas方法结合直接检测宫颈癌的POCT试剂盒，所述试剂盒是检测SEPT9基因启动子SEPT9:77373475
‑
77373595片段的甲基化试剂盒，所述试剂盒包括：组分1：其包括甲基化敏感限制性内切酶，所述限制性内切酶消化人基因组DNA，此时甲基化修饰的目的序列片段会保持完整而非甲基化的序列片段会被特异性的切割；组分2：其包括等温扩增试剂，所述等温扩增试剂对于所述甲基化修饰的目的序列片段进行扩增，得到双链DNA，而所述非甲基化的序列片段则不进行等温扩增；和组分3：CRISPR/Cas12a试剂，所述试剂对所述双链DNA进行特异性识别，进而激活Cas12a酶反式切割活性切割具有荧光基团的单链报告DNA，产生荧光信号以直接检测所述甲基化修饰的目的序列片段。
[0008]在一种实施方式中，所述甲基化敏感限制性内切酶是核酸内切酶BstUI，所述等温扩增试剂是RPA等温扩增试剂。
[0009]在一种实施方式中，所述CRISPR/Cas12a试剂包括crRNA、Cas12a酶和具有荧光基团的单链报告DNA，所述crRNA引导Cas12a酶识别所述双链DNA，对所述甲基化修饰的目的序列片段进行特异性切割，所述双链DNA中包括与crRNA特异性结合的核酸片段，该核酸片段起始序列是TTTN序列,N为A、C、G三者中任意一种碱基；所述具有荧光基团的单链报告DNA被激活的Cas12a酶切割后产生荧光信号以进行特异性的检测。
[0010]在一种实施方式中，所述基因组DNA浓度为不高于2.5ng/μL。
[0011]在一种实施方式中，所述核酸内切酶BstUI浓度为不低于0.75U/μL，优选地为1U/μL。
[0012]在一种实施方式中，所述RPA等温扩增试剂中镁离子浓度为10
‑
25mM，优选地为10mM。
[0013]在一种实施方式中，所述RPA等温扩增的扩增时间为5
‑
30分钟，优选为15分钟。
[0014]在一种实施方式中，所述RPA等温扩增试剂中引物浓度为100
‑
600nM，优选地为400nM。
[0015]在一种实施方式中，所述RPA等温扩增试剂中温度为38
‑
43℃，优选地为42℃。
[0016]在一种实施方式中，所述Cas12a反应温度为35
‑
45℃，优选地为45℃。
[0017]当前已有的甲基化基因检测方法，如金标准亚硫酸盐依赖方法需要强酸和高温等严苛条件导致的DNA降解和检测失败，MSRE虽然反应条件温和可以避免DNA降解，但消化不完全导致检测准确度和灵敏度有待提高。
[0018]与现有技术的DNA甲基化检测方法相比，当前其他技术用的都是线性的DNA检测难度较低，没有用具有超螺旋结构的基因组DNA，因此本专利技术所述方法用的是基因组DNA更贴近临床应用，且检出限较低，检测范围较宽。此外，整个反应可以在1h内完成，因此非常适合即时检测(POCT)。
[0019]具体地，本专利技术提供了一种基于甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)技术的等温扩增(RPA)与CRISPR/Cas12a(MeCRISPR)系统结合DNA甲基化检测系统，与传统的甲基化特异性PCR相比，基于核酸内切酶BstUI的RPA反应条件温和，检测速度快(整个反应低于1h)。在DNA甲基化检测中表现出良好的性能，能够对极低低浓度(1copy/μL)和含量(0.01％)的甲基化水平进行准确检测。此外，MeCRISPR在宫颈癌临床检测中的灵敏度和特异性可高达100％和
92.3％，具有极好的应用价值和前景。
[0020]本专利技术利用BstUI的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测宫颈癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测SEPT9基因启动子SEPT9:77373475
‑
77373595的甲基化试剂。2.一种基于等温扩增方法和CRISPR/Cas方法结合直接检测宫颈癌的POCT试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测SEPT9基因启动子SEPT9:77373475
‑
77373595片段的甲基化试剂盒，所述试剂盒包括：组分1：其包括甲基化敏感限制性内切酶，所述限制性内切酶消化人基因组DNA，此时甲基化修饰的目的序列片段会保持完整而非甲基化的序列片段会被特异性的切割；组分2：其包括等温扩增试剂，所述等温扩增试剂对于所述甲基化修饰的目的序列片段进行扩增，得到双链DNA，而所述非甲基化的序列片段则不进行等温扩增；组分3：CRISPR/Cas12a试剂，所述试剂对所述双链DNA进行特异性识别，进而激活Cas12a酶反式切割活性切割具有荧光基团的单链报告DNA，产生荧光信号以直接检测所述甲基化修饰的目的序列片段。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶是核酸内切酶BstUI，所述等温扩增试剂是RPA等温扩增试剂。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a试剂包括crRNA、Cas12a酶和具有荧光基团的单链报告DNA，所述crRNA引导Cas12a酶识别所述双链DNA，对所述甲基化修饰的目的序列片段进行特异性切割...

【专利技术属性】
技术研发人员：李旭辉，徐文飞，
申请(专利权)人：敬善生物科技江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：