本发明专利技术提供了一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括第一上游引物、第二上游引物和第三上游引物，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述第二上游引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述第三上游引物由模板重叠序列、模板匹配区序列和阻遏序列依次连接组成，所述第三上游引物的序列如SEQIDNO.3所示，所述第一下游引物的序列如SEQIDNO.4所示，所述第二下游引物的序列如SEQIDNO.5所示。本发明专利技术解决了Sanger测序中对于突变含量较低的样本难以有效检测的问题。同时本发明专利技术提供了一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒及其使用方法。方法。方法。
【技术实现步骤摘要】
用于检测BRAF基因V600E突变的引物、试剂盒及其使用方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学基因检测
，尤其涉及一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
[0002]BRAF，即B
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Raf原癌基因，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，编码RAF蛋白激酶的家族成员之一。BRAF是受RAS调控的丝氨酸
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苏氨酸激酶和MAPK信号通路的激活因子，细胞外信号通过这一途径调节细胞增殖、分化和存活。自2002年以来，BRAF基因突变已被证实广泛分布于肿瘤中，诸如黑色素瘤、甲状腺癌、结肠癌和非小细胞肺癌等。绝大部分突变发生在第15号外显子第1799位核苷酸胸腺嘧啶和腺嘌呤的替换。因此，BRAF基因V600E位点的检测对癌症的诊断、预后和预测具有重要作用。
[0003]在临床实践中，BRAF突变主要是基于DNA的分析，并利用聚合酶链式反应(英文简称：PCR)进行检测。常见的方法有一代测序(一代测序即Sanger测序)、等位基因特异性扩增(英文简称：ARMS
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PCR)和高分辨率溶解曲线分析(英文简称：HRM)。其中HRM是根据DNA序列的物理性质，应用高分辨率溶解曲线对样本进行分析，灵敏度可达到1％，但由于对核酸序列Tm值差异有较高要求，反应孔间0.1℃的差异就无法保证分析准确性，因此其对于检测仪器的要求非常高，常规的检验室无法满足该技术要求；ARMS
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PCR通常设计有两对上游引物，分别与突变DNA和正常DNA互补，扩增时只有与突变DNA序列完全互补的引物才能延伸复制，并通过与其结合探针的荧光信号值进行检测，该方法的检测灵敏度可达到1％，但因其方法学的限制，只能检测已知突变，且受限于聚合酶的保真性，引物在碱基错配的情况下仍可以延伸扩增，易产生假阳性结果。Sanger测序是BRAF突变检测的金标准，相比其他两种方法能以较低的成本分析未知DNA序列，但是其检测灵敏度只有约20％，对于突变含量较低的样本难以有效检测。
[0004]因此，有必要开发一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物、试剂盒及其使用方法以解决现有技术存在的上述问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物、试剂盒及其使用方法，以解决Sanger测序中对于突变含量较低的样本难以有效检测的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的所述用于检测BRAF基因V600E突变的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括第一上游引物、第二上游引物和第三上游引物，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三上游引物由模板重叠序列、模板匹配区序列和阻遏序列依次连接组成，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0007]本专利技术的所述用于检测BRAF基因V600E突变的引物的有益效果在于：所述第三上
游引物由模板重叠序列、模板匹配区序列和阻遏序列依次连接组成，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第三上游引物能够使得第二次PCR扩增过程中差异竞争性扩增突变体序列，从而显著提高突变产物占总扩增产物的比例，使得Sanger测序的灵敏度从20％提高至1％，所述引物均没有进行额外的化学修饰、生物素或荧光基团标记，使得引物的成本低廉，可以应用于临床大范围检测BRAF基因V600E突变。本专利技术解决了Sanger测序中对于突变含量较低的样本难以有效检测的问题。
[0008]可选的，所述第一上游引物与模板序列完全匹配，所述第二上游引物与模板序列完全匹配，所述第一下游引物与模板序列完全匹配，所述第二下游引物与模板序列完全匹配。
[0009]本专利技术的又一目的是提供一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，包括引物混合液A和引物混合液B，所述引物混合液A包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物混合液B包括第二上游引物、第三上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]本专利技术的所述用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒的有益效果在于：所述试剂盒通过两次PCR扩增，在富集靶向序列的基础上，所述试剂盒包含所述第三上游引物，所述第三上游引物高度亲和野生DNA模板，但因其阻遏序列抑制了引物正常延伸，使得第二次PCR扩增过程中差异竞争性扩增突变体序列，从而显著提高突变产物占总扩增产物的比例，使得Sanger测序的灵敏度从20％提高至1％，所述试剂盒中的引物均没有进行额外的化学修饰、生物素或荧光基团标记，使得引物的成本低廉，从而使得试剂盒的制造成本低廉，因此所述试剂盒可应用于临床大范围检测BRAF基因V600E突变。同时本专利技术所述试剂盒具有检测灵敏度高和特异性好的优点。
[0011]可选的，所述第一上游引物在所述引物混合液A中的浓度为0.02μM～2μM，所述第一下游引物在所述引物混合液A中的浓度为0.02μM～2μM。
[0012]可选的，所述第二上游引物在所述引物混合液B中的浓度为0.4μM～50μM，所述第三上游引物在所述引物混合液B中的浓度为0.8μM～60μM，所述第二下游引物在所述引物混合液B中的浓度为0.4μM～50μM。
[0013]可选的，所述用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒还包括反应缓冲液A、反应缓冲液B、酶混合液、纯化缓冲液和阳性质控品。
[0014]可选的，所述阳性质控品包括BRAF基因V600E纯合突变的gDNA标准品，所述gDNA标准品在所述阳性质控品中的浓度为40ng/μL。
[0015]本专利技术的又一目的是提供一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0016]S0：获取基因组DNA，并将所述基因组DNA作为模板，提供引物混合物A、反应缓冲液A、引物混合物B、反应缓冲液B、酶混合液和纯化缓冲液；
[0017]S1：将所述引物混合物A、所述反应缓冲液A和所述基因组DNA混匀进行第一次PCR扩增以得到第一轮PCR产物；
[0018]S2：将所述引物混合物B、所述反应缓冲液B和所述第一轮PCR产物混匀进行第二次
PCR扩增以得到第二轮PCR产物；
[0019]S3：将所述酶混合液、所述纯化缓冲液和所述第二轮PCR产物混匀进行纯化以得到纯化产物。
[0020]本专利技术的所述用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒的使用方法的有益效果在于：通过两次PCR扩增，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测BRAF基因V600E突变的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括第一上游引物、第二上游引物和第三上游引物，所述下游引物包括第一下游引物和第二下游引物，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三上游引物由模板重叠序列、模板匹配区序列和阻遏序列依次连接组成，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因V600E突变的引物，其特征在于，所述第一上游引物与模板序列完全匹配，所述第二上游引物与模板序列完全匹配，所述第一下游引物与模板序列完全匹配，所述第二下游引物与模板序列完全匹配。3.一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，包括引物混合液A和引物混合液B，所述引物混合液A包括第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物混合液B包括第二上游引物、第三上游引物和第二下游引物，所述第二上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述第三上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求3所述的用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其特征在于，所述第一上游引物在所述引物混合液A中的浓度为0.02μM～2μM，所述第一下游引物在所述引物混合液A中的浓度为0.02μM～2μM。5.根据权利要求3所述的用于检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘磊，段爱丽，陆孝亮，吴晓刚，
申请(专利权)人：上海安甲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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