制备诱导型肝实质细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了制备诱导型肝实质细胞的方法及其应用。本发明专利技术的方法可有效避免HNF1A、HNF4A及FOXA3病毒质量对转分化来源的肝实质细胞纯度及功能稳定性的影响，确保终末肝实质细胞的功能稳定性。本发明专利技术也提供了由所述方法制备得到的肝实质细胞。制备得到的肝实质细胞。

【技术实现步骤摘要】
制备诱导型肝实质细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，更具体地，本专利技术涉及制备诱导型肝实质细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]肝脏是人体内的最大分泌腺体，其同时具有内分泌和外分泌功能。内分泌功能主要为分泌多种激素如胰岛素样生长因子，血管紧张肽原，促血小板生成素。与之对应的外分泌功能则为胆汁的合成。肝细胞以胆固醇为原料，经多个步骤合成初级胆汁酸，其中关键酶为胆固醇7α
‑
羟化酶。将胆固醇转化为胆汁酸，这是肝脏清除胆固醇的主要方式。此外，肝脏在人体内的重要作用还表现在：(1)糖原储存，肝脏将血液中多余的葡萄糖以肝糖原的形式储存，为机体大量耗能之时提供能量；(2)药物代谢及解毒功能，肝脏内药物代谢及解毒酶类分为
①
药物代谢一相酶，其主要家族为CYP450超家族，其参与外源及内源有机物质的氧化作用；
②
药物代谢二相酶，其主要是以一相酶反应产物为底物进行结合反应的催化酶类；
③
药物代谢三相酶，其主要作用为将肝脏细胞内代谢有毒物质转出肝脏；(3)调节胆固醇的合成和转运；(4)尿素代谢；(5)分泌血清蛋白，幼年肝脏分泌的主要血清蛋白为AFP，在成年肝脏中主要的血清蛋白为白蛋白(ALB)，此外肝脏还分泌血清胰蛋白酶抑制剂AAT(Si
‑
Tayeb et al.,2010)。
[0003]正因肝脏具有如此重要的生理功能，肝炎，肝硬化，急慢性肝衰竭等肝脏疾病为家庭和社会带来了严重的经济负担。现阶段对于重症肝病患者最有效的治疗方法为肝脏移植，然而，肝脏供体来源十分短缺。因此，找到新型的治疗方法为亟需解决的问题。近来生物人工肝治疗为肝病患者带来了福音。目前，应用于生物人工肝装置的种子细胞为一些替代性肝实质细胞，主要有永生化人原代肝实质细胞、人肝癌细胞系、猪肝细胞、人成纤维细胞转分化来源的肝实质细胞及人类诱导多能干细胞来源的肝实质细胞。
[0004]然而，临床实践中，永生化肝细胞功能受限，核型往往不稳定；人癌细胞系丢失了诸多肝脏细胞重要功能，并存在较大的致癌隐患；猪肝细胞则面临动物疾病传播的风险；多能干细胞来源的肝实质细胞存在畸胎瘤形成的风险；人成纤维细胞转分化方法中三因子病毒的生产稳定性严重影响终末肝实质细胞的纯度及功能稳定性，且转分化来源的肝实质细胞在扩增过程往往伴随肝实质细胞功能的丢失。因此，本领域亟需研发新型的、安全有效的替代性肝实质细胞作为生物人工肝的种子细胞。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供制备诱导型肝实质细胞的方法及其应用。
[0006]在本专利技术的第一方面，提供一种制备诱导型肝实质细胞的方法，所述方法包括：
[0007](1)以成纤维细胞为起始细胞(供体细胞)，制备永生化细胞；
[0008](2)在(1)的细胞中，引入以下元件：反义Tet转录活化因子(rtTA)；
[0009](3)在(2)的细胞中，引入依次(上游至下游，或5
’
至3
’
)串联的下组元件：四环素调
控元件(TRE)，FOXA3，HNF1A，HNF4A；
[0010](4)在(3)的细胞中，引入依次(上游至下游，或5
’
至3
’
)串联的下组元件：四环素调控元件(TRE)，HNF4A，从而获得诱导型肝实质细胞。
[0011]在一个或多个实施方式中，所述方法还包括步骤：利用强力霉素(Doxycycline，Dox)或4
‑
表强力霉素(4
‑
epidoxycycline，4
‑
ED)处理(4)的细胞，诱导细胞表达FOXA3，HNF1A，HNF4A；较佳地，诱导0.5～10天(优选地诱导1～8天，更优选地诱导1.5～6天，如2、3、4或5天)。
[0012]在一个或多个实施方式中，所述方法还包括步骤：对(4)获得的肝实质细胞进行传代培养，获得传代的细胞。
[0013]在一个或多个实施方式中，所述的元件之间为操作性连接。
[0014]在一个或多个实施方式中，所述方法制备的肝实质细胞睾酮代谢能力显著提升。
[0015]在一个或多个实施方式中，所述肝实质细胞包括细胞培养物或分离/纯化的细胞。
[0016]在一个或多个实施方式中，所述永生化细胞是衰老或凋亡途径被破坏(或抑制)的细胞。
[0017]在一个或多个实施方式中，所述成纤维细胞是离体细胞，或是细胞培养物。
[0018]在一个或多个实施方式中，所述诱导型肝实质细胞是离体细胞，或是细胞培养物。
[0019]在一个或多个实施方式中，所述FOXA3，HNF1A，HNF4A包括其变体。
[0020]在一个或多个实施方式中，所述的HNF4A或其变体是：(a1)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b1)在(a1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1
‑
30个，较佳地1
‑
20个，较佳地1
‑
10个，更佳地1
‑
5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽；或(c1)与(a1)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a1)多肽功能的由(a1)衍生的多肽。
[0021]在一个或多个实施方式中，所述的HNF1A或其变体是：(a2)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b2)在(a2)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1
‑
30个，较佳地1
‑
20个，较佳地1
‑
10个，更佳地1
‑
5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽；或(c2)与(a2)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽。
[0022]在一个或多个实施方式中，所述的FOXA3或其变体是：(a6)SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽；或(b6)在(a6)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个(如1
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30个，较佳地1
‑
20个，较佳地1
‑
10个，更佳地1
‑
5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽；或(c6)与(a6)限定的蛋白序列有90％(较佳地95％；更佳地98％；更佳地99％)以上同源性且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽。
[0023]在一个或多个实施方式中，(1)中，所述的成纤维细胞是脐带成纤维细胞；或，所述的成纤维细胞是哺乳动物来源的成纤维细胞。
[0024]在一个或多个实施方式中，(1)中，通过引入SV40大T抗原(Lar本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备诱导型肝实质细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)以成纤维细胞为起始细胞，制备永生化细胞；(2)在(1)的细胞中，引入以下元件：反义Tet转录活化因子；(3)在(2)的细胞中，引入依次串联的下组元件：四环素调控元件，FOXA3，HNF1A，HNF4A；(4)在(3)的细胞中，引入依次串联的下组元件：四环素调控元件，HNF4A，从而获得诱导型肝实质细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：利用强力霉素或4
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表强力霉素处理(4)的细胞，诱导细胞表达FOXA3，HNF1A，HNF4A；较佳地，诱导0.5～10天；或所述方法还包括步骤：对(4)获得的肝实质细胞进行传代培养，获得传代的细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的成纤维细胞是脐带成纤维细胞；或，所述的成纤维细胞是哺乳动物来源的成纤维细胞；和/或(1)中，通过引入SV40大T抗原制备永生化细胞，或通过引入人端粒酶逆转录酶制备永生化细胞。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，所述FOXA3与HNF1A之间，所述HNF1A与HNF4A之间以2A进行连接；较佳地，所述FOXA3与HNF1A之间以E2A连接；较佳地，所述HNF1A与HNF4A之间以T2A连接。5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，利用病毒来引入所述的元件、SV40大T抗原或人端粒酶逆转录酶；较佳地，所述病毒包括：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒；较佳地，将所述元件构建于病毒载体、包装成病毒、感染细胞；更佳地，所述病毒为慢病毒；更佳地，在感染时：(2)中，MOI为10～120...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯思思，田娥，潘妍，
申请(专利权)人：上海微知卓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：