一种核酸检测试剂盒及其在核酸检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸检测试剂盒及其在核酸检测中的应用，核酸检测试剂盒包括探针1、探针2、上游引物1和上游引物2；探针1和探针2分别与等位基因的两个不同碱基所处的DNA模板互补，5

【技术实现步骤摘要】
一种核酸检测试剂盒及其在核酸检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种核酸检测试剂盒及其在核酸检测中的应用。

技术介绍

[0002]近年来伴随着人类遗传学的研究，发现人的遗传多样性与疾病或其他性状相关联。不同个体的单核苷酸多态性，即在不同个体的基因组DNA中某一单核苷酸位点的差异，不仅可能会影响疾病产生的机制、也会对个体对药物的反应等带来影响。
[0003]因单碱基多态性在临床中的检测价值，目前已经出现了多种相关检测技术，但是存在着或多或少的各种问题，限制着单碱基多态性的广泛应用。（1）一代测序方法，如Sanger测序、焦磷酸测序等，需要依赖昂贵的设备，操作步骤复杂。（2）基因芯片法，操作步骤复杂，需要依赖专业设备，成本高。（3）二代测序，成本高，周期长，设备昂贵。（4）荧光PCR方法，成本低，通用性好，一直在临床检测中被广泛应用，同时在该方法的基础上也衍生出多种改良的方法，如AMRS
‑
PCR、熔解曲线法等，但是依然存在着特异性不好，灵敏度不足、操作复杂等各种问题。因此急需开发一种特异性好、灵敏度高的基因检测方法以满足临床检测的需求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中核酸检测中存在的特异性不好、敏度不足、操作复杂的问题，本专利技术提供了一种核酸检测试剂盒及其在核酸检测中的应用，通过在靶标位点碱基位置设计扩增阻滞引物与探针的单碱基占位重叠，造成引物与探针的单碱基同时占位，引入了引物与探针的单碱基结合位点竞争关系，进而保证了单碱基多态性检测过程中的高特异性和高灵敏度。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现（权利要求书）：一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括探针1、探针2、上游引物1和上游引物2；所述的探针1和探针2分别与等位基因的两个不同碱基所处的DNA模板互补，探针1和探针2的5
’
端第一个碱基，分别为等位基因某个位点的两个不同碱基在DNA模板中所在的位置；所述的上游引物1和上游引物2，分别与等位基因的两个不同碱基所处的DNA模板互补，上游引物1和上游引物2的3
’
端第一个碱基，分别为等位基因某个位点的两个不同碱基在DNA模板中所在的位置；所述的探针1和探针2序列的T
m
值均比上游引物1和上游引物2的Tm值高出8~15℃。
[0006]进一步地，所述的上游引物1的3
’
端第一个碱基与探针1的5
’
端第一个碱基相同，上游引物2的3
’
端第一个碱基与探针2的5
’
端第一个碱基相同。
[0007]进一步地，所述的上游引物1和上游引物2的长度为13~32bp，T
m
值为55~65℃。
[0008]进一步地，所述的探针1和探针2的长度为10~26 bp，T
m
值为60~75℃。
[0009]进一步地，所述的探针1和探针2的3
’
端修饰有淬灭基团，5
’
端修饰有荧光基团。
[0010]进一步地，所述的淬灭基团为BHQ1、BHQ2、MGB
‑
NFQ、BHQ3等中的一种；所述的荧光基团为FAM、VIC、CY5、CY3、ROX、JOE、TET、NED、TAMRA等中的一种。
[0011]本专利技术中，所述的试剂盒在核酸检测中的应用。
[0012]进一步地，在核酸检测中的扩增体系中含有DNA聚合酶，具有DNA聚合酶活性和5
’‑3’
外切酶活性，无3
’‑5’
外切酶活性。
[0013]本专利技术在PCR时，当存在DNA模板的情况下，因探针1和探针2的Tm值比上游引物1和上游引物2温度高，所以探针1和探针2会优先于引物随机与DNA模板先结合在一起，随后上游引物1和上游引物2也均会随机与DNA模板结合。本专利技术中的核酸检测原理图如图1~3所示，图1为纯合子AA的核酸检测原理图；图2为纯合子GG的核酸检测原理图，图3为杂合子AA/GG的核酸检测原理图，结合图1~3，核酸检测的机理具体为：（1）当结合在DNA模板上的探针1的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基互补时，因结合位置被探针1的5
’
端第一个碱基所占用，与探针1结合在同一条DNA模板的上游引物1的3
’
端第一个碱基，没有位置再与此DNA模板结合，造成上游引物1无法延伸，无法水解探针1，无法释放出探针1的荧光信号。
[0014]（2）当结合在DNA模板上的探针1的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基互补时，因结合位置被探针1的5
’
端第一个碱基所占用，与探针1结合在同一条DNA模板的上游引物2的3
’
端第一个碱基，与此DNA模板不互补，同时也无位置与此DNA模板结合，造成上游引物2无法延伸，无法水解探针1，无法释放出探针1的荧光信号。
[0015]（3）当结合在DNA模板上的探针1的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基不互补时，因此探针1的5
’
端第一个碱基未占用此DNA模板的对应位置，与探针1结合在同一条DNA模板的上游引物1的3
’
端第一个碱基，与此DNA模板也不互补，造成上游引物1无法延伸，无法水解探针1，无法释放出探针1的荧光信号。
[0016]（4）当结合在DNA模板上的探针1的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基不互补时，因此探针1的5
’
端第一个碱基未占用此DNA模板的对应位置，与探针1结合在同一条DNA模板的上游引物2的3
’
端第一个碱基，与此DNA模板互补，上游引物2延伸，水解探针1，释放出探针1的荧光信号。即，当上游引物2延伸时，释放出探针1的荧光信号。
[0017]（5）当结合在DNA模板上的探针2的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基互补时，因结合位置被探针2的5
’
端第一个碱基所占用，与探针2结合在同一条DNA模板的上游引物2的3
’
端第一个碱基，没有位置再与此DNA模板结合，造成上游引物2无法延伸，无法水解探针2，无法释放出探针2的荧光信号。
[0018]（6）当结合在DNA模板上的探针2的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基互补时，因结合位置被探针2的5
’
端第一个碱基所占用，与探针2结合在同一条DNA模板的上游引物1的3
’
端第一个碱基，与此DNA模板不互补，同时也无位置与此DNA模板结合，造成上游引物1无法延伸，无法水解探针2，无法释放出探针2的荧光信号。
[0019]（7）当结合在DNA模板上的探针2的5
’
端第一个碱基与DNA模板的碱基不互补时，因此探针2的5
’
端第一个碱基未占用此DNA模板的对应位置，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，包括探针1、探针2、上游引物1和上游引物2；所述的探针1和探针2分别与等位基因的两个不同碱基所处的DNA模板互补，探针1和探针2的5
’
端第一个碱基，分别为等位基因某个位点的两个不同碱基在DNA模板中所在的位置；所述的上游引物1和上游引物2，分别与等位基因的两个不同碱基所处的DNA模板互补，上游引物1和上游引物2的3
’
端第一个碱基，分别为等位基因某个位点的两个不同碱基在DNA模板中所在的位置；所述的探针1和探针2序列的T
m
值均比上游引物1和上游引物2的Tm值高出8~15℃。2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的上游引物1的3
’
端第一个碱基与探针1的5
’
端第一个碱基相同，上游引物2的3
’
端第一个碱基与探针2的5
’
端第一个碱基相同。3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的上游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：金日虎，古恒森，白龙云，
申请(专利权)人：山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：