可靶向清除非洲猪瘟病毒的重组腺病毒及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可靶向清除非洲猪瘟病毒的重组腺病毒及制备方法和应用。通过将Cas9基因和P72

【技术实现步骤摘要】
可靶向清除非洲猪瘟病毒的重组腺病毒及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种可靶向清除非洲猪瘟病毒的重组腺病毒及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的家猪、野猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100％。自1907年首次发生到现在100多年来，国外科学家一直在不断尝试研究疫苗，但是目前没有可用的商品化疫苗，也从来没有出现过有效的商品化疫苗。2018年8月初，非洲猪瘟首次传入我国，已在多地发生，对我国生猪产业的健康稳定发展构成巨大威胁。
[0003]随着DNA重组技术的发展和利用，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗的研究热点。重组病毒活载体疫苗是以病毒为载体，在真核细胞中表达外源基因，它在病毒病的防治等方面展现了广阔的前景，其中以腺病毒作为病毒载体的研究近年来十分活跃。与传统疫苗相比，重组病毒活载体疫苗具有使用安全、免疫力持久。Cas9蛋白是一种DNA内切酶，能在引导RNA的引导下结合到与引导RNA互补配对的DNA序列位点，并发挥DNA内切活性，切断DNA双链。CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因编辑技术(Pennisi E.The CRISPR craze[J].Science，2013，341(6148):833
‑
6)，被science和nature评为2013年科学十大进展之一，但在医疗临床实践和畜牧业生产等方面，特别是在兽医防控领域还未得到实质应用。
[0004]p72是ASFV主要的结构蛋白，由B646L基因编码，是病毒二十面体衣壳的重要组成成分，存在于病毒衣壳的表面，具有良好的免疫原性和抗原性。p72参与病毒的吸附，针对p72的抗体可以阻断病毒与巨噬细胞的结合。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种可靶向清除非洲猪瘟病毒的重组腺病毒及制备方法和应用，以解决上述问题。
[0006]根据本专利技术的第一个方面，提供了一种重组腺病毒，该重组腺病毒可用于靶向清除非洲猪瘟病毒，该腺病毒的基因组中插入了Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸。
[0007]在某些实施方式中，该腺病毒插入的Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0008]根据本专利技术的第二个方面，提供了一种重组腺病毒的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0009]1)P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA的设计及合成；
[0010]2)将Cas9基因和P72
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sgRNA序列合成Cas9基因和P72
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sgRNA双链寡核苷酸表达盒Cas9
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P72序列，将Cas9
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P72序列克隆入pMD
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18T载体，得到pMD
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Cas
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P72质粒
[0011]3)将pMD
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Cas9
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P72与pShuttle
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CMV酶切后再转化，获得pShuttle
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Cas9
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P72穿梭质粒；
[0012]4)将穿梭质粒pShuttle
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Cas9
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P72与骨架质粒pAdEasy
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1在感受态中同源重组，获得同源重组质粒，然后将同源重组质粒线性化后转染293细胞，培养直至细胞中形成岛屿状感染区的趋势，反复冻融3次收获即得重组腺病毒rAdV
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Cas9
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P72。
[0013]在某些实施方式中，靶序列P72
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sgRNA如SEQ ID No:2所示；Cas9基因和P72
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sgRNA双链寡核苷酸表达盒Cas9
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P72序列如SEQ ID No:1所示。
[0014]根据本专利技术的第三个方面，提供了一种具备抗非洲猪瘟免疫力猪的制备方法，该制备方法包括如下步骤：将制备的重组腺病毒导入猪受精胚胎，然后将受精卵移植入代孕母猪子宫内，待小猪出生后进行DNA采样并检测Cas9基因为阳性的小猪即为携带有重组腺病毒的阳性小猪，该小猪具备抗非洲猪瘟的免疫力。
[0015]在某些实施方式中，重组腺病毒导入猪受精胚胎可通过与猪受精胚胎孵育或将重组腺病毒注射入受精胚胎方式来实现。
[0016]根据本专利技术的第四个方面，提供了一种重组腺病毒在靶向清除非洲猪瘟病毒上的应用，该重组腺病毒的基因组中插入了Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸；进一步地，该腺病毒插入的Cas9基因及P72基因靶向P72
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sgRNA双链寡核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0017]在某些实施方式中，所述应用可通过向猪肌肉注射如权利要求1或2中所述的重组腺病毒来使所述猪具备抗非洲猪瘟的免疫力。
[0018]在某些实施方式中，所述应用还可以通过向猪受精胚胎导入如权利要求1或2中所述的重组腺病毒来使出生的小猪具备抗非洲猪瘟的免疫力。
[0019]根据本专利技术的第五个方面，提供了一种重组腺病毒在非洲猪瘟防疫上的应用，该重组腺病毒的基因组中插入了Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸；进一步地，该腺病毒插入的Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]1、制备获得了一种重组腺病毒，该病毒基因组中插入了Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸。因此，在应用的时候，通过将该重组腺病毒载入猪中，一旦该猪感染了非洲猪瘟病毒，非洲猪瘟病毒可以快速被Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸系统识别并对P72进行靶向敲除/清除，从而使非洲猪瘟病毒失效而达到消除非洲猪瘟病毒的作用。且由于腺病毒可以自我复制，其携带的Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸基因序列也处于不断复制更新的状态，可以更好的在活体动物(猪)的生命周期里持续不间断的发挥敲除/清除非洲猪瘟病毒的效果。而采用腺病毒作为载体，相较于基因编辑等手段，可以不用引入外源基因并且也不会破坏猪的自身基因组，不会造成猪的生物安全问题，应用时更加便捷有效。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒，其中，所述重组腺病毒可用于靶向清除非洲猪瘟病毒，所述腺病毒的基因组中插入了Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其中，所述重组腺病毒的基因组中插入的Cas9基因及P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA双链寡核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。3.权利要求1或2中所述的重组腺病毒的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：1)P72基因的CRISPR靶序列P72
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sgRNA的设计及合成；2)将Cas9基因和P72
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sgRNA序列合成Cas9基因和P72
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sgRNA双链寡核苷酸表达盒Cas9
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P72序列，将Cas9
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P72序列克隆入pMD
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18T载体，得到pMD
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Cas
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P72质粒3)将pMD
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Cas9
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P72与pShuttle
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CMV酶切后再转化，获得pShuttle
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Cas9
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P72穿梭质粒；4)将穿梭质粒pShuttle
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Cas9
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P72与骨架质粒pAdEasy
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【专利技术属性】
技术研发人员：李群辉，周庆丰，林丽苗，蔡新斌，李薇，周美华，曹雪珍，罗洋洋，
申请(专利权)人：温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：