腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术是一株腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物及其应用，所述引物包括2条非特异性的外侧引物和2条特异性检测SNP突变位点的内测引物，所述2条外侧引物具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列或其互补序列，所述2条内侧引物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的序列或其互补序列。该检测引物及其应用设计验证基于ARMS

【技术实现步骤摘要】
腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，特别涉及一种腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物及其应用。

技术介绍

[0002]腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是指腹主动脉局限性扩张至3.0cm以上，或较原直径增大1.5倍以上。这类疾病发病率随着年龄的增长而随之升高，在74～84岁人群中，男性AAA发病率可达12.5％，而女性达5.2％。大多数的AAA并无明显症状，但当AAA破裂时病人临床上常有典型的三联症：突发低血压、腹部或背部剧痛以及腹部搏动性包块，且其病死率非常高。与AAA有关的主要危险因素包括男性、吸烟、年龄65岁以上、伴冠状动脉疾病，高血压、有心肌梗死、外周动脉疾病病史和有AAA家族史。由此可见，针对高危人群，制作一种高效、便捷、敏感性和特异性高的检测方法非常必要。
[0003]单核苷酸多态性(SNPs)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记。SNP具有已知性、可遗传性、可检测性，可用于疾病基因的定位、克隆和鉴定，寻找疾病相关的突变位点。rs12070918位点位于人的chr1:201212089(GRCh38.p13)，该区域编码IGFN1基因。先前研究表明，该位点的突变和AAA的发生有一定联系。
[0004]ARMS中文名称为突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)，ARMS
‑
PCR将ARMS技术和基因PCR技术相结合，其基本原理为引物3
′
端碱基与模板完全互补配对时，引物能正常进行延伸。如果引物的3
′
端碱基与模板碱基不互补，即存在错配，引物延伸被抑制甚至是完全终止。这种方法常被用来检测SNP位点的变异性。
[0005]由此可见，设计出一种利用ARMS
‑
PCR的方法检测腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的引物及其应用，具有潜在的临床意义并能够提供巨大的市场价值。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一株腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物及其应用，该检测引物及其应用设计验证基于ARMS
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PCR方法的特异性匹配rs12070918位点的引物，并完善反应体系和反应条件，使其成功完成目的基因的扩增和检测，对于临床具有积极的意义。
[0007]为达到此目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一株腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物，所述引物包括2条非特异性的外侧引物和2条特异性检测SNP突变位点的内测引物，所述2条外侧引物具有SEQ ID NO.1(正向引物)和SEQ ID NO.2(反向引物)所示的序列或其互补序列，所述2条内侧引物具有SEQ ID NO.3(正向引物)和SEQ IDNO.4(反向引物)所示的序列或其互补序列；
[0009]SEQ ID NO.1如下：TAAAGCCATGGGTCACAGGT
[0010]SEQ ID NO.2如下：TGAAAGAGTCTGTCGCCCTC
[0011]SEQ ID NO.3如下：GGGTAGCATCAGAGGGTGA
[0012]SEQ ID NO.4如下：GACCATCCTTGGAGTTCGGGC。
[0013]其中2条特异性检测SNP突变位点的内测引物分别对应了SNP位点rs12070918(A/G)的多态性。
[0014]由于突变型反向引物SEQ ID NO.4的3
′
端会和野生型模板发生弱错配(C/A)，为提高检测的特异性以及准确性，故在该引物倒数第三个碱基中人工引入强错配(G/A)；并优化反应体系和反应条件，适当提高PCR退火温度，保持在56℃；使其成功完成目的基因的扩增和检测，显著提高检测的特异性以及准确性，具有潜在的临床意义。
[0015]为提升引物的特异性以及准确性，在引物设计过程中需注意：
[0016]引物3
′
端碱基与模板完全互补配对时，引物能正常进行延伸。如果引物的3
′
端碱基与模板碱基不互补，即存在错配，引物延伸被抑制甚至是完全终止。
[0017]为提高引物特异性，可在3
′
端倒数第3位碱基处额外引入一个错配碱基，使引物可正常扩增靶序列，而非目的片段不扩增。
[0018]进一步，3
′
端碱基错配依据其强度可分为强错配(G/A、C/T、T/T)、中错配(A/A、G/G、C/C)和弱错配(C/A、G/T)；若3
′
端为强错配则应人工引入一个弱错配碱基或不引入错配碱基，类似的针对3
′
端的中错配以及弱错配应人工引入一个中错配以及强错配碱基。
[0019]对纯合野生型或突变型样本进行检测，会生成一条的非特异性DNA产物以及分别产生一条长度不同特异性DNA引物，而对杂合突变性样本进行检测，则会生成一条非特异性DNA产物以及两条长度不同特异性DNA引物。
[0020]一种腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物的应用，用于制备检测腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的试剂盒，其中包括：
[0021]无RNA酶的水和缓冲液；
[0022]2×
SYBR Green Master Mix；
[0023]上述的四种引物；
[0024]其中，两种分别为野生型和突变型SNP位点rs12070918的500拷贝数的阳性质粒pUC57
‑
3040作为阳性质控；无核酸水作为阴性质控。
[0025]进一步，所示试剂盒检测步骤应满足以下几步：
[0026]S1，样品DNA的提取；
[0027]S2，配制反应体系，进行ARMS
‑
PCR，检测样品DNA的SNP位点rs12070918基因型。
[0028]准备4个PCR管并放入反应体系液体：3.6μM无RNA酶的水、5μM 2
×
SYBR Green Master Mix、0.4μM Primer Mix。并在8管中分别加入1μM的样本DNA、野生型阳性质粒、突变型阳性质粒、无核酸水，每个反应放入双管设置双重复。所述ARMS
‑
PCR的反应条件为：维持50℃2min，95℃2min；40个循环95℃15s，56℃15s，72℃60s。
[0029]S3，检测结果及其有效性分析
[0030]将4个PCR管进行DNA凝胶电泳分析，若两种阳性质控分别产生一条非特异性条带以及一条特异性条带且阴性质控未产生条带则说明实验结果有效。
[0031]将样本DNA与两种阳性质控的特异性条带进行对照则可分析出样本DNA S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物，其特征在于，所述引物包括2条非特异性的外侧引物和2条特异性检测SNP突变位点的内测引物，所述2条外侧引物具有SEQ ID NO.1(正向引物)和SEQ ID NO.2(反向引物)所示的序列或其互补序列，所述2条内侧引物具有SEQ ID NO.3(正向引物)和SEQ ID NO.4(反向引物)所示的序列或其互补序列；SEQ ID NO.1如下：TAAAGCCATGGGTCACAGGTSEQ ID NO.2如下：TGAAAGAGTCTGTCGCCCTCSEQ ID NO.3如下：GGGTAGCATCAGAGGGTGASEQ ID NO.4如下：GACCATCCTTGGAGTTCGGGC。2.根据权利要求1所述的腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物，其特征在于在突变型反向引物SEQ ID NO.4的倒数第三个碱基中人工引入强错配(G/A)；并优化反应体系和反应条件，适当提高PCR退火温度，保持在56℃。3.根据权利要求1所述的腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物，其特征在于引物3
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端碱基与模板完全互补配对时，引物能正常进行延伸；在3
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端倒数第3位碱基处额外引入一个错配碱基，使引物可正常扩增靶序列，而非目的片段不扩增。4.根据权利要求3所述的腹主动脉瘤相关SNP位点rs12070918的检测引物，其特征在于3
′
端碱基错配依据其强度可分为强错配(G/A、C/T、T/T)、中错配(A/A、G/G、C/C)和弱错配(C/A、G/T)；若3
′
端为强错配则应人工引入一个弱错配碱基或不引入错配碱基，针对3
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端的中错配以及弱错配应人工引入一个中错配以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岚，王海，李一男，
申请(专利权)人：张岚，
类型：发明
国别省市：