红细胞中叶酸和5-甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种红细胞中叶酸和5

【技术实现步骤摘要】
红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法。

技术介绍

[0002]叶酸（Folic Acid）也称蝶酰谷氨酸，是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的一种重要的B族水溶性维生素，其在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，对正常红细胞的形成有促进作用。叶酸缺乏与多种疾病的发生有关，准确检测人体内叶酸水平是评价叶酸营养状态的基础。长期以来，临床检验中一般是对人血清或血浆中叶酸含量的测定，来判断人体叶酸的缺乏与否。近年来，经研究证明红细胞中叶酸含量是血清或血浆中叶酸的含量的10 ~ 20倍，且血浆或血清叶酸代表体内循环状态的叶酸水平，但易受到膳食等因素影响，其浓度水平波动较大。而红细胞叶酸与红细胞更新过程有关，反映人体内叶酸的长期变化状态和叶酸储备情况，因此红细胞叶酸测量可以更加准确地反映组织贮存情况。红细胞叶酸浓度被视为能够最可靠地反映叶酸状态的指标。
[0003]叶酸并非是单一分子，是由一系列的衍生物组成。活性叶酸是5
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甲基四氢叶酸，是稳定性的天然叶酸，无需代谢，可直接进入循环，被人体吸收利用。5
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甲基四氢叶酸是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的82%~93%，因此叶酸的测定重点测定非代谢型叶酸和5
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甲基四氢叶酸。
[0004]文献中有两种方法估算红细胞叶酸浓度。第一种方法是根据全血叶酸浓度推算红细胞叶酸浓度。具体地，首先取出一小份全血，测量红细胞压积；再取出一小份全血，测得全血叶酸浓度。再将全血叶酸浓度除以红细胞压积以估算红细胞叶酸浓度。这种方法由于忽略了血浆叶酸的贡献及占比的差异性，会造成红细胞叶酸浓度高估和不准确。第二种方法是先测得红细胞压积和全血叶酸浓度，再将同一管血离心取得血浆，测得血浆叶酸浓度，再根据公式“红细胞叶酸＝[全血叶酸
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血浆叶酸(1
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红细胞压积)]/红细胞压积”估算出红细胞叶酸。这种方法的缺陷是需要分别做血浆和全血的叶酸检测，增加了检测误差和成本。
[0005]在全血叶酸提取方面，根据文献报道，样本前处理阶段需要复杂的前处理过程，包括冻融裂解（
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80℃冰箱内快速冷冻至少30分钟）、加标稀释、热变失活（90℃加热15分钟）、水解孵育（37℃或常温孵育3小时）和固相萃取（包括活化、平衡、上样、淋洗、洗脱）等步骤，所处理得到的样本氮气吹干复溶后进入液相色谱
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串联质谱进行检测。上述前处理技术即增加了成本，降低了效率，也有可能因步骤多而增加了检测误差。
[0006]为了进一步提高红细胞叶酸检测的效率、同时提高检测的灵敏度和准确性，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的检测方法及前处理方法。
[0008]本专利技术提供了一种红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的检测方法，至少包括以下步骤：S1、制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清；S2、样本前处理，包括：S21、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；S22、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；S23、在S22中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；S24、在S23中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；S3、检测所述待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的浓度。
[0009]可选的，制备标准曲线方程时使用的标准溶液还含有红细胞裂解液和蛋白沉淀剂，经混合后离心得到标准溶液进样液；所述红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH4Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO3和0.05 ~ 0.15 mmol/L的Na2EDTA的水溶液；所述蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液。
[0010]本专利技术提供了一种采用高效液相色谱串联质谱法检测红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的前处理方法，至少包括以下步骤：S1
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、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；S2
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、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH4Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO3和0.05 ~ 0.15 mmol/L的Na2EDTA的水溶液；S3
’
、在S2
’
中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；所述动物血清选自大鼠血清或人血清；S4
’
、在S3
’
中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液；混合内标工作液先采用溶解试剂配制标准储备液，再采用稀释液稀释得到，所述溶解试剂为甲醇和0.05 ~ 0.5 mol/L氨水体积比为1：1的混合溶液；稀释剂为甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量百分比为0.1% ~ 2%的2,6
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二叔丁基对甲酚和/或质量百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇。
[0011]本专利技术实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：首先，本专利技术获得红细胞进行处理，直接获得实验结果，不需要检测其他指标进行换算。
[0012]其次，本专利技术简化了前处理的步骤，缩短整个前处理时长，降低了成本。
[0013]最后，本专利技术通过将动物血清同时加入到标准工作液中的方式来抵消动物血清中内源性叶酸和5
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甲基四氢叶酸带来的影响，无需对动物血清进行去除叶酸和5
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甲基四氢叶
酸的操作，简化了前处理步骤，提高了检测的准确性。同时本专利技术标准工作液中无需加入红细胞基质，也能实现很好的准确度，避免了对红细胞基质去除叶酸和5
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甲基四氢叶酸的操作，简化了标曲前处理的步骤。
附图说明
[0014]图1为实施例1中标准溶液中叶酸的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；图2为实施例1中标准溶液中5
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甲基四氢叶酸的色谱图（左图为标准物质，右图为内标物质）；图3为实施例1中待测样本红细胞叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；图4为实施例1中待测样本红细胞5
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甲基四氢叶酸的色谱图（左图为待测物质，右图为内标物质）；图5为本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：S1、制备标准曲线方程，制备标准曲线方程所使用的标准溶液中添加有动物血清；S2、样本前处理，包括：S21、将EDTA抗凝血离心，获得血细胞；S22、在血细胞中加入混合内标工作液和红细胞裂解液，裂解一段时间后离心取上清；S23、在S22中获得的上清中加入动物血清，混合后酶解一段时间；S24、在S23中获得的酶解产物中加入蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，混合后离心，取上清为待测样本；S3、检测所述待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中红细胞中叶酸和5
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甲基四氢叶酸的浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，制备标准曲线方程时使用的标准溶液还含有红细胞裂解液和蛋白沉淀剂，经混合后离心得到标准溶液进样液；所述红细胞裂解液为：含有140 ~ 160 mmol/L的NH4Cl、5 ~ 15 mmol/L的KHCO3和0.05 ~ 0.15 mmol/L的Na2EDTA的水溶液；和/或，所述蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，S1包括：S11、配制梯度浓度的混合标准工作液、混合内标工作液；所述混合标准工作液中含有叶酸标准品和5
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甲基四氢叶酸标准品，所述混合内标工作液中含有叶酸内标标准品和5
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甲基四氢叶酸内标标准品；S12、将梯度浓度的所述混合标准工作液中分别加入所述混合内标工作液，再加入动物血清和红细胞裂解液，制备得到梯度浓度的标准溶液；S13、将所述标准溶液中加入蛋白沉淀剂，混合后离心，取上清为所述标准溶液进样液；S14、使用高效液相色谱质谱联用仪对所述标准溶液进样液进行检测，获得标准曲线方程。4.根据权利要求1~3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述动物血清选自大鼠血清或人血清；和/或，所述蛋白沉淀剂选自质量体积百分比为3% ~ 10%的磺基水杨酸水溶液或体积百分比为3% ~ 10%高氯酸水溶液；和/或，所述混合内标工作液的稀释剂为含甲醇和水体积比为3：7的混合溶液，水中含有质量体积百分比为0.1% ~ 2%的2,6
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二叔丁基对甲酚和/或质量体积百分比为0.1% ~ 1%的二硫苏糖醇。5.根据权利要求1~3任一项所述的检测方法，其特征在于，在S1和S2的每个检测体系内，所加入的动物血清的体积相同；和/或，在S1和S2的每个检测体系内，所加入的蛋白沉淀剂的体积均相同；和/或，在S1的每个检测体系内，所述混合标准工作液与所述红细胞裂解液的体积比为V1，在S2的每个检测体系内，血细胞与红细胞裂解液的体积比为V2，V
1 = V2。
2%的2...

【专利技术属性】
技术研发人员：解娜，贾永娟，刘春冉，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：