一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用。本发明专利技术基于柑橘黄龙病菌中多拷贝的噬菌体CLasMV1与CLas的同源基因位点设计了特异性实时荧光PCR引物GP04

【技术实现步骤摘要】
一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用


[0001]本专利技术涉及植物病理分子诊断
，更具体地，涉及一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物及其应用。

技术介绍

[0002]柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)是柑橘生产中最具毁灭性的病害之一，严重威胁着柑橘产业的健康发展。早在1919年，Reinking对华南地区的主要经济作物病害调查时就发现并记录了柑橘黄龙病的黄化斑驳症状。最初黄龙病在我国广东、福建、广西三省发现黄龙病猖獗危害，其后陆续蔓延至四川、江西、云南等地，直至20世纪80年代我国的浙江、贵州、湖南等11个柑橘种植区都相继受害。目前柑橘黄龙病已在世界范围内的50多个国家和地区蔓延和为害。
[0003]柑橘植株在生长中的各个时期都可以感染黄龙病，但染病后症状和受危害的严重程度因植株抗病性、生长时期、环境条件等各不相同。发病植株的典型症状为新叶均匀黄化或呈缺锌状，老叶斑驳，并且部分叶片发育畸形，呈凹凸不平或卷曲状。发病植株开花早、花细小畸形、易脱落，发病后期树根基本腐烂，木质部常变黝黑与皮部分离。病果体积小、形状不对称、味道淡。沙糖桔等柑橘品种病果成熟时着色常从茎端开始，形成“红鼻子果”的症状，而橙类等易出现“青果”，成熟时期较健康植株早但易脱落。
[0004]我国的柑橘黄龙病由α
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变形菌纲的韧皮部杆菌属亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”，CLas)所引起，CLas分布范围最广、危害最重，是在中国流行的最主要的病原种。
[0005]在缺乏有效治疗方法和优良抗病品种的情况下，感染黄龙病植株的早期检测和检疫、清除传染源和传播媒介是防止病菌入侵无病柑橘产区的重要管理策略。然而黄龙病症状复杂，进行田间诊断时易于与缺素和柑橘衰退病等病症混淆。利用指示植物、电镜观察、血清学检测等方法也可以起到一定程度的鉴别作用，但各有缺陷，比如检测耗时较长、对检测样品有限制、容易漏检、检出率较低、试剂仪器昂贵等。尽管黄龙病属于系统侵染性病害，但CLas在植株体内各个部位的浓度并不相同，分布不均和含量偏低导致柑橘黄龙病早期诊断检测的准确性和可靠性较低。HLB的潜伏期较长，结合低滴度和最初模糊的症状，使得在柑橘黄龙病大流行的早期阶段检测非常困难。目前有关黄龙病的检测主要依赖于分子检测，其中以实时荧光定量PCR检测最为常用。检测靶标主要为CLas基因组上的多拷贝保守基因，如16S rRNA基因、nrdB基因等，然而检测灵敏度低，无法适用于果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacterspp”浓度较低的情况，实际应用效果不理想。因此需要开发出更高灵敏度的检测方法来更早发现感染柑橘黄龙病的植株，以及时挖出病株清除传染源或采取其他防治措施。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物。本专利技术基于CLasMV1噬菌体与CLas同源基因设计引物GP04
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F/GP04
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R，同时使用双重引物GP04
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F/GP04
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R和CLas
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4G/HLBr进一步完善和提高了检测的灵敏度，可在果树感染黄龙病初期病原“Ca.Liberibacter spp.”浓度较低的阶段进行初步诊断，以及时挖出病株清除传染源或采取其他防治措施。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供所述基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病检测引物的应用。
[0008]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009]一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物，包括引物对GP04
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F/GP04
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R，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。
[0010]本专利技术基于柑橘黄龙病菌中多拷贝的噬菌体CLasMV1与CLas的同源基因位点(ORF4，其序列如SEQ ID NO.5所示)设计特异性Real
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time PCR引物，从而建立较为完善的高灵敏分子检测体系。当黄龙病样本中含有CLasMV1噬菌体时，本专利技术GP04
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F/GP04
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R引物能显著提高黄龙病菌的检测灵敏性，同时也可用于不含有CLasMV1噬菌体的黄龙病菌检测。
[0011]优选地，还包括引物对CLas
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4G/HLBr，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.3～4所示。当在CLas低浓度的条件下使用双重引物同时检测能显著提高检测的灵敏性，为实验室检测CLas提供了进一步的技术支持。
[0012]本专利技术还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
[0013]本专利技术还提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种的检测方法，包括如下步骤：
[0014]S1.提取待测样品基因组DNA；
[0015]S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物进行单重或双重实时荧光PCR反应，若实时荧光定量PCR检测得到的Ct值大于32则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若Ct值小于32则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种。
[0016]优选地，所述步骤S2所述单重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 8.0μL，Supermix 10.0μL，10μmol/L GP04
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F 0.5μL，10μmol/L GP04
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R 0.5μL，DNA模板1.0μL，共20μL；双重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 7.0μL，Supermix 10.0μL，10μmol/L CLas
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4G 0.5μL，10μmol/L HLBr 0.5μL，10μmol/L GP04
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F 0.5μL，10μmol/L GP04
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R 0.5μL，DNA模板1.0μL，共20μL。
[0017]优选地，步骤S2所述单重或双重实时荧光PCR反应的反应条件为：95℃，3min；95℃10s，60℃30s，40个循环；在每个循环的60℃结束时进行荧光信号读取。
[0018]本专利技术还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在制备柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒中的应用。
[0019]本专利技术还提供一种柑橘黄龙病菌亚洲种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物。
[0020]优选地，所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂。
[0021]本专利技术还提供上述任一所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。
[0022]由于CLasMV1噬菌体在柑橘黄龙病菌中的高拷贝数和该类型噬菌体在地域上分布广泛等特点，使用大量田间样品对该体系进行验证后发现，本专利技术的单重或双重实时荧光PC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于噬菌体基因为靶标的柑橘黄龙病菌检测引物，其特征在于，包括引物对GP04
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F/GP04
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R，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～2所示。2.根据权利要求1所述柑橘黄龙病菌检测引物，其特征在于，还包括引物对CLas
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4G/HLBr，其上下游引物序列依次如SEQ ID NO.3～4所示。3.权利要求1或2所述柑橘黄龙病菌检测引物在检测柑橘黄龙病菌亚洲种中的应用。4.一种柑橘黄龙病菌亚洲种的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测样品基因组DNA；S2.以步骤S1的DNA为模板，利用权利要求1或权利要求2所述柑橘黄龙病菌检测引物进行单重或双重实时荧光PCR反应，若实时荧光定量PCR检测得到的Ct值大于32则表示待测样品未感染柑橘黄龙病亚洲种，若Ct值小于32则表示待测样品感染柑橘黄龙病亚洲种。5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于，所述步骤S2所述单重实时荧光PCR反应的扩增体系为：ddH2O 8.0μL，Supermix 10.0μL，10μmol/L GP04
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F0.5μL，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑正，李紫怡，邓晓玲，许美容，张玲，王成，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：