一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法技术

本发明专利技术涉及一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测技术及方法。具体地，本发明专利技术提供检测DNA甲基化的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一种或多种。本方法利用检测粪便肠癌相关基因甲基化水平，实现更高准确率更低成本的肠癌无创筛查目的。查目的。

【技术实现步骤摘要】
一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种粪便肠癌多靶点甲基化基因检测技术及方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌(CRC，大肠癌)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，对男性和女性均有影响。随着人们生活习惯的改变，其发病率和死亡率明显上升。由于大部分患者在早期未能及时发现并得到治疗，肠癌死亡率居高不下。
[0003]肠癌是高发癌症中最适合筛查的癌症之一。肠癌发生缓慢，需要十年及以上的时间，通常是从结肠或直肠小的非癌性息肉开始的，如果通过筛查，肠癌可以早期被发现。早发现早治疗最有可能成功，因此肠癌又是最容易治愈的癌症之一。早期肠癌患者手术5年生存率达90％以上，而中晚期患者5年生存率仅10％左右。在美国，通过肠癌早期筛查，肠癌发病率降低了近40％，死亡率下降了51％。因此，早筛，早诊，早治疗对肠癌显得尤为重要。
[0004]目前，传统的肠癌检测方法有多种，但均存在不足。其中，粪便隐血检测(FOBT/FIT)常用于临床，检测简便，成本低，受检者可自行取样，但是灵敏度和特异性较低；CT检查对早期以及小直径病灶检出率有限，且存在辐射；肠镜检查是肠癌诊断的金标准，但是侵入性，患者依从性低，有肠穿孔和麻醉风险。
[0005]粪便DNA检测作为一种新兴的肠癌无创筛查，其灵敏性和特异性均优于粪便隐血检测，是一种无创、无痛，用户依从性好的筛查方式。但是国内市场上肠癌筛查产品的检测基因比较单一，所以本领域仍需一种灵敏度更高的检测方法。

技术实现思路
<br/>[0006]本专利技术提供了一种对样品中多个基因甲基化水平进行检测，利用检测粪便肠癌相关基因甲基化水平，实现更高准确率更低成本的肠癌无创筛查目的。
[0007]本专利技术第一方面提供检测DNA甲基化的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述DNA序列至少包含TFPI2和ITGA4；进一步地，所述DNA序列还包含SDC2和VIM中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：NDRG4和BMP3中的一个或两个，例如NDRG4和任选的BMP3。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含TFPI2和ITGA4。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述试剂用于检测肠癌或肠癌前病变。
[0011]在一个或多个实施方案中，所述DNA序列包含至少3个CpG二核苷酸。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述的片段长度为1
‑
1000bp，优选1
‑
700bp。
[0013]在一个或多个实施方案中，所述片段是基因序列的启动子区域。
[0014]在一个或多个实施方案中，所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸。
[0015]在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述DNA序列或其片段或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。
[0016]在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
[0017]在一个或多个实施方案中，所述引物至少包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19；进一步地，所述引物还包含组(1)SEQ ID NO:12和13与(2)SEQ ID NO:16和17中的任一组或两组；更进一步地，所述引物还包含：组(3)SEQ ID NO:8和9与(4)SEQ ID NO:10和11中的任一组或两组。
[0018]在一个或多个实施方案中，所述引物包含SEQ ID NO:14和15以及SEQ ID NO:18和19。进一步地，所述引物还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:12和13，(2)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13，(3)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:16和17，(4)NDRG4、SEQ ID NO:12和13，(5)SEQ ID NO:16和17，(6)SEQ ID NO:8和9、SEQ ID NO:10和11、SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:16和17。
[0019]在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5
’
端荧光报告基团和3
’
端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。
[0020]在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针，所述检测探针具有SEQ ID NO:22
‑
27中任一项或多项或全部所示的序列。
[0021]在一个或多个实施方案中，所述探针至少包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27；进一步地，所述DNA序列还包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26中的一个或两个；更进一步地，所述DNA序列还包含：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中的一个或两个。
[0022]在一个或多个实施方案中，所述探针包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。进一步地，所述DNA序列还包含以下任一组：(1)SEQ ID NO:24，(2)SEQ ID NO:22、EQ ID NO:23、SEQ ID NO:24，(3)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26，(4)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24，(5)SEQ ID NO:26，(6)SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26。
[0023]在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:22所示的探针具有可检测物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.诊断肠癌或肠癌前病变、筛查肠癌形成或形成的风险或评估肠癌进展或预后的试剂，所述试剂包含检测对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4。2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述DNA序列至少包含TFPI2和ITGA4；优选地，所述DNA序列还包含SDC2和VIM中的一个或两个；更优选地，所述DNA序列还包含：NDRG4和BMP3中的一个或两个；进一步优选地，所述DNA序列包含TFPI2、ITGA4和以下任一组：(1)SDC2，(2)NDRG4、BMP3、SDC2，(3)NDRG4、SDC2、VIM，(4)NDRG4、SDC2，(5)VIM，(6)NDRG4、BMP3、SDC2、VIM。3.如权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述片段是基因序列的启动子区域，和/或所述片段包含至少1个CpG二核苷酸，和/或所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的引物分子，和/或所述试剂是与所述DNA序列或其片段或它们经转化的序列杂交的检测探针，优选地，所述引物具有选自以下任一组或多组或全部的序列：(1)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9，(2)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11，(3)SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13，(4)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15，(5)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，(6)SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19，所述检测探针具有SEQ ID NO:22
‑
27中任一项或多项或全部所示的序列，所述对象是哺乳动物；优选地，所述样品来自哺乳动物的粪便。4.物质在制备用于诊断对象肠癌或肠癌前病变或筛查肠癌高危人群的试剂盒中的用途，所述物质包含：(a)用于确定对象样品中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂或装置，和任选的(b)所述DNA序列或其片段经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，任选的(c)用于捕获所述DNA序列或其片段的捕获试剂，任选的(d)处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，例如将能够未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，其中，所述DNA序列包括以下基因序列：NDRG4、BMP3、SDC2、TFPI2、VIM和ITGA4中的一种或多种。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述片段是基因序列的启动子区域，和/或所述片段包含至少1个CpG二核苷酸，和/或所述(a)包含权利要求3所述的试剂，和/或(c)所述捕获试剂是相应基因的特异性捕获试剂；优选地，捕获试剂包含SEQ ID NO:1
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6中任一项或多项所示的捕获探针，和/或(d)所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂；优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖国伟，龚伟伟，
申请(专利权)人：上海长岛抗体诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：