本发明专利技术属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。本发明专利技术以Claudin18.2蛋白为靶点，制备靶向Claudin18.2的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，经试验验证，其能够特异性识别和清除Claudin18.2阳性肿瘤细胞，特别适用于胃癌的治疗，因此具有良好的实际应用之价值。之价值。之价值。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用
[0001]本专利技术属于生物医药和分子生物学
，具体涉及一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
[0002]本专利技术
技术介绍
中公开的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]胃癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，每年约有100万新确诊病例。尽管手术技术进步很大，化疗方案也有很大改进，但晚期胃癌患者的5年生存率约为5％
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20％，中位总生存期(OS)约为10个月。大部分胃癌患者确诊时，病情已经进入中晚期，手术后效果极不理想，且预后极差，是临床上极为棘手的恶性肿瘤。因此，迫切需要开发延长治疗胃癌患者生命的策略。
[0004]细胞间紧密连接是一种跨膜蛋白复合体，紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持，而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20～27KD，结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环，其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白，位于相临细胞间隙顶侧，其分布具有组织器官特异性，功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。Claudin18蛋白分子量约为26KD，Claudin18基因具有2个不同的第一外显子，可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型：Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异，但表达分布却不同，Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达，在任何其他正常人器官中完全检测不到，但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调，包括80％的胃肠道腺瘤、60％的胰腺肿瘤、30％食道癌以及25％非小细胞肺癌。在肿瘤中，细胞间的紧密连接遭到破坏，Claudin18.2无法发挥其正常功能。生存分析表明，胃癌中Claudin18表达减少与晚期患者的预后差有关，认为Claudin18表达减少是胃癌患者预后不佳的因素。因此，Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。
[0005]Ganymed Pharmaceuticals AG已开发出针对CLDN18.2的IgG1嵌合抗体IMAB362。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN18.2的第一胞外结构域(ECD1)。IMAB362不与任何其它密蛋白家族成员结合，包括紧密相关的密蛋白18剪接变体1(CLDN18.1)。IMAB362表现出精确的肿瘤细胞特异性，并且组合了四中独立的高度有效的作用机制。靶标结合后，IMAB362通过ADCC、CDC、诱导通过肿瘤细胞表面上的靶标交联诱导的凋亡以及直接一直增殖来介导细胞杀伤。因此，IMAB362有效裂解CLDN18.2阳性细胞，包括体外和体内的人胃癌细胞系。具有CLDN18.2阳性癌细胞系的小鼠具有生存益处，并且当用IMAB362处理时，多至
40％的小鼠表现出其肿瘤的退化。
[0006]细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的疾病治疗模式。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。表达嵌合抗原受体的T细胞在治疗恶性血液病方面表现出了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了广阔的前景。嵌合抗原受体T细胞(简称CART或CAR
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T)是从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的CART细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。
技术实现思路
[0007]针对现有技术中的不足，本专利技术提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体及其应用。本专利技术以Claudin18.2蛋白为靶点，制备靶向Claudin18.2的纳米抗体，并进一步获得人源化纳米抗体，构建二代CAR质粒载体，通过分离T细胞，用编码CAR的慢病毒载体进行编程，从而获得一种表达靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，经试验验证，其能够特异性识别和清除Claudin18.2阳性肿瘤细胞，特别适用于胃癌的治疗。基于上述研究成果，从而完成本专利技术。
[0008]为了实现上述技术目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其中，所述抗原结合域含有抗Claudin18.2单域抗体；
[0010]其中，所述抗Claudin18.2单域抗体的氨基酸序列选自：
[0011]a1)如SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的氨基酸序列；或，
[0012]a2)与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列；该氨基酸序列仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合Claudin18.2和诱导T细胞信号传导功能。
[0013]本专利技术的第二个方面，提供一种多聚核苷酸，其能编码如第一方面所述的嵌合抗原受体。
[0014]本专利技术的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第二方面所述的核苷酸。
[0015]本专利技术的第四个方面，提供一种工程化的免疫细胞，所述免疫细胞为T细胞，具体的，所述T细胞是由上述靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。所述T细胞为CAR
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T细胞。本专利技术所采用的针对Claudin18.2的CAR
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T技术，是一种综合肿瘤单克隆抗体的免疫治疗和肿瘤的过继免疫治疗优点的靶向治疗技术。本专利技术为Claudin18.2表达相关肿瘤特别是胃癌的CAR
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T治疗提供了新的治疗手段。
[0016]本专利技术的第五个方面，提供第一方面所述嵌合抗原受体、第二方面所述核苷酸、第三方面所述的重组表达载体、第四方面所述T细胞在如下任意一种或多种中的应用：
[0017]b1)制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞；
[0018]b2)制备肿瘤治疗药物。
[0019]本专利技术的第六个方面，提供一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物其活性成分至
少包含第四方面所述T细胞。
[0020]本专利技术的第七个方面，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括：所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述T细胞或药物。
[0021]上本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其至少包含抗原结合域、跨膜结构域和至少一个胞内结构域，其特征在于，所述抗原结合域含有抗Claudin18.2单域抗体；其中，所述抗Claudin18.2单域抗体的氨基酸序列选自：a1)如SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24所示的氨基酸序列；或，a2)与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项序列具有≥80％序列同一性的序列，或与SEQ ID NO.3、5、7、14、16、18、20、22、24任一项所示的序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列；且仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合Claudin18.2和诱导T细胞信号传导功能。2.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域和/或CD28跨膜结构域；所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。3.如权利要求1所述的靶向Claudin18.2的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；所述共刺激信号传导结构域包括但不限于人4
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1BB胞内区、人CD28胞内区、人CD27胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区或人OX40胞内区中的任意一种或多种的组合，优选为人CD28胞内区；所述人CD28胞内区的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述CD3ζ信号传导域其核苷酸序列如SEQ ID NO....
【专利技术属性】
技术研发人员：孙卫平，韦雨萌，
申请(专利权)人：邦恩泰山东生物医药科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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