一种重组尿酸氧化酶聚乙二醇前药缀合物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种重组尿酸氧化酶聚乙二醇前药缀合物及其制备方法。该前药缀合物为重组尿酸氧化酶rUOX与聚乙二醇PEG的前药缀合物PEG

【技术实现步骤摘要】
一种重组尿酸氧化酶聚乙二醇前药缀合物及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种重组尿酸氧化酶聚乙二醇前药缀合物及其制备方法，即重组尿酸氧化酶(rUOX)的PEG化的前药缀合物(PEG
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UOX)，它比可获得的重组尿酸氧化酶(rUOX)蛋白具有更长的半衰期，可以更少频率的使用，同时比传统PEG修饰的尿酸氧化酶减少细胞空泡的产生几率，可降低引起心血管疾病的潜在风险性。

技术介绍

[0002]尿酸氧化酶(UOX)
[0003]尿酸氧化酶(尿酸氧化还原酶，EC1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)参与生物体嘌呤代谢过程。嘌呤是机体内重要的生物活性分子，嘌呤核苷酸分解产生的产物黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生尿酸，尿酸可进一步分解为尿囊素、尿囊酸、CO2和NH3。尿酸氧化酶将尿酸氧化为尿囊素。人类和一些灵长类动物体内缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人类和这些动物嘌呤代谢的最终产物。尿酸溶解度较低，经尿酸氧化酶的作用后成为溶解度更高的尿囊素，使核酸代谢产物更容易排出体外。
[0004]根据2019年《中国高尿酸血症和痛风诊疗指南》，目前我国高尿酸血症患者接近1.7亿，患病率达到了13.3％。同时，痛风患者也已超过了1800万，患病率在1％～3％左右，已成为继糖尿病之后又一常见代谢性疾病。现有针对高尿酸血症的药物普遍存在起效慢、降尿酸不彻底、对肝肾毒副作用大、对体内已经形成的痛风石无效等问题。
[0005]针对高尿酸血症发病机制，临床常用药物可分为抑制尿酸形成和促进尿酸排泄两类。别嘌醇是临床一线抑制尿酸形成类药物，能够通过抑制XO活性来减少次黄嘌呤和黄嘌呤向尿酸转化，降低了体内尿酸水平，但临床研究表明，别嘌醇对高尿酸血症患者的有效率仅为40％，说明大多数患者发生高尿酸血症的主要原因并不完全在于尿酸过度产生。长期使用别嘌醇会引起药疹、发热、肝肾功能损害、胃肠道反应或超敏反应综合征。促进尿酸排泄药物主要包括苯溴马隆、丙磺舒等，可以通过增加尿量、抑制部分转运体对尿酸的重吸收降低体内尿酸水平，长期服用苯溴马隆可引起线粒体功能障碍，产生肝毒性。肾功能不全患者服用丙磺舒降尿酸作用不明显。由此可见，虽然高尿酸血症发病机制相对明确，但临床治疗药物种类较少，特别值得注意的是，临床通过限制高嘌呤食物摄取，也可以一定程度缓解尿酸的过度产生，因此，促进尿酸排泄药物的需求大于减少尿酸产生药物的需求。开发促进尿酸排泄新药具有较好的临床应用前景。
[0006]现有针对高尿酸血症的药物普遍存在起效慢、降尿酸不彻底、对肝肾毒副作用大、对体内已经形成的痛风石无效等问题。尿酸氧化酶药物直接分解尿酸成易溶无毒的尿囊素直接排出体外，可快速降低患者体内尿酸水平，且不增加肝肾负担。聚乙二醇化尿酸氧化酶则在尿酸氧化酶基础上降低了毒性，延长了药物体内停留时间，可使患者尿酸水平长期保持在低位。对于慢性或顽固性患者，此类产品优于现有药物。
[0007]聚乙二醇修饰
[0008]聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种pH中性，无毒，水溶性较高的亲水聚
合物，其重复单元为氧乙烯基，端基为两个羟基，呈线性或支化链状结构。通过将活化的聚乙二醇用化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体等药物载体上，可改善这些药物的疗效或扩大其应用范围。
[0009]本领域普遍认为，经聚乙二醇修饰后，大多数蛋白质的性质会发生以下变化：免疫原性与抗原性降低；循环半衰期延长；溶解性增加；耐蛋白酶水解；生物利用度提高；毒性降低；热稳定性及机械稳定性增加；等电点、电泳行为、动力学性质等改变。另外，很重要的一点是蛋白质经聚乙二醇修饰后会引起细胞学活性降低，主要原因为终产品中引进的基团，包括PEG以及PEG和修饰蛋白质之间的连接键所致，也与偶联的条件、产生的副产物等有关。
[0010]聚乙二醇修饰蛋白质技术已广泛应用于生物医药领域，目前上市的PEG化蛋白药物中，氨基修饰较为多见。如Roche公司的PEG修饰的干扰素α
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2a、Schering
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Plough公司的PEG修饰的干扰素α
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2b，在血清中清除速度减慢，减少了用药次数；PEG修饰ADA、PEG修饰G
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CSF，2010年FDA批准上市的治疗痛风新药聚乙二醇化尿酸氧化酶等。这些经修饰后的药物，被证明半衰期延长，免疫原性减弱，减少了给药次数，提高了疗效大大降低了免疫原性，减小了给药频次。
[0011]聚乙二醇化尿酸氧化酶(PEG
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UOX)
[0012]通常情况下，PEG化的尿酸氧化酶可能通过增加其体内半衰期(从而实现剂量减少或给药频率降低)、改善其稳定性和降低其抗原性或它们的组合来改善分子特性。
[0013]通常，对分子进行该类型的修饰是本领域众所周知的并且专利文献中可获得很多专利，这些专利描述了这种概念。例如，在专利CN114438047A、CN102260653A、CN102757945A、CN102634492A、CN101928704A、CN101302501A、CN101198693A中，均描述了不同序列尿酸氧化酶蛋白被不同活性基团、不同分子量的聚乙二醇修饰，修饰后的产物是蛋白与PEG进行永久键合后形成聚合物
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药物(PEG
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UOX)结合物，根据文献显示，这一类PEG修饰后的蛋白类药物能诱导细胞内产生功能未知的空泡(Young M A,Malavalli A,Winslow N,et al..Toxicity and hemodynamic effects after single dose administration of MalPEG
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hemoglobin(MP4)in rhesus monkeys.Transl.Res.,2007,149(6):333
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342；Xu J,Bussiere J,Yie J,et al..Polyethylene glycol modified FGF21engineered to maximize potency and minimize vacuole formation.Bioconjug.Chem.,2013,24(6):915
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25.)。目前仍未发现该空泡的相关功能作用，但是心脏大血管上皮细胞内的空泡有可能产生结节，有引起心血管疾病—冠心病的潜在风险(FDA."Center for drug evaluation and research."<http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2010/125293Orig1s000PharmR.pdf>,Cited October 17,2013.)。另外肾小管上皮细胞内空泡的积累会导致肾小管弯曲变形，有导致本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组尿酸氧化酶聚乙二醇前药缀合物，其特征在于，该前药缀合物为重组尿酸氧化酶rUOX与聚乙二醇PEG的前药缀合物PEG
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UOX，其中PEG通过自身可水解的且自动裂解的暂时连接子linker与重组尿酸氧化酶rUOX连接，其具有以下结构，其中，n为95～119的正整数，k为8～10之间的正整数。2.根据权利要求1所述的前药缀合物，其特征在于，所述的重组尿酸氧化酶rUOX是通过基因工程技术获得的重组尿酸氧化酶，其序列来源于微生物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或序列来源于哺乳动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或序列来源于无脊椎动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或序列来源于植物的重组尿酸氧化酶及其突变体。3.根据权利要求2所述的前药缀合物，其特征在于，所述重组尿酸氧化酶rUOX序列来源于黄曲霉的尿酸氧化酶基因序列。4.如权利要求1所述的前药缀合物，其特征在于，所述的聚乙二醇为含单一活性功能基团的直链单甲氧基聚乙二醇，其中活性功能基团通过自身可水解的且自动裂解的暂时连接子linker与单甲氧基聚乙二醇分子连接，带有连接子的聚乙二醇分子结构式如下：其中n为75～994的正整数，R为封端基，选自：烷氧基、羟基、氨基、羧基、巯基、酯基、酮基、醛基、邻二硫吡啶基、叠氮基、酰肼基、炔基、硅烷基、马来酰亚胺基或琥珀酰亚胺基。5.根据权利要求4所述的前药缀合物，其特征在于，所述的封端基R为琥珀酰亚胺基，所述的带有连接子的聚乙二醇分子，结构式如下：其中n为95～119的正整数。6.根据权利要求1所述的前药缀合物，其特征在于：所述聚乙二醇的平均分子量为4kDa～40kDa。7.如权利要求1
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6任意一项所述前药缀合物PEG
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UOX的制备方法，其特征在于，包括
如以下步骤：采用纯度大于95％的重组尿酸氧化酶蛋白，蛋白终浓度为1
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8mg/ml，采用聚乙二醇的平均分子量为4kDa～40kDa...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘翔，
申请(专利权)人：修正生物医药杭州研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：