用于制备和使用心内膜细胞的方法和组合物技术

描述了用于从多能干细胞中制备心内膜细胞的方法和组合物，以及用于使用此类细胞的方法与组合物。法与组合物。法与组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备和使用心内膜细胞的方法和组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月8日提交的美国申请第63/021,999号的权益。在先申请的公开内容被认为是本申请公开内容的一部分并通过引用包含于此。


[0003]本专利技术涉及心内膜细胞，以及用于制备和使用这种细胞的方法和组合物。

技术介绍

[0004]心脏由心肌细胞和非心肌细胞谱系组成，这些谱系是在胚胎发育期间在不同的时间从不同的祖细胞群体中特化的。不同细胞类型之间的相互作用对于心脏发育以及维持体内稳态和成人器官的正常功能至关重要。心脏发育的最早阶段之一是原始心管的形成，它由被外层心肌细胞包围的内层特化内皮细胞(也称为心内膜细胞)组成。这些心内膜细胞在心脏发育中起着关键作用，因为它们负责诱导第一个功能性心肌细胞群体，即，小梁心肌细胞。
[0005]小梁心肌细胞形成指状突起，也称为小梁，其突出到正在发育的心房和心室的内腔中，在胚胎期生活起到快速增加肌肉质量的作用。通过由心内膜细胞分泌的神经调节蛋白通过神经调节蛋白/ERBB2信号传导介导心肌细胞中小梁命运的诱导。这些早期诱导步骤对于正常的心脏发育至关重要，因为心内膜特化和形成的破坏导致无小梁形成、成熟度受损和胚胎致死。除了形成第一收缩组织外，小梁心肌层还产生传导系统细胞亚群体浦肯野纤维。随着发育的进行，小梁心肌层的大部分被由紧凑心肌细胞组成的紧凑心肌层所取代。紧凑心肌层形成成人心脏功能所需的力产生组织。
[0006]除了小梁心肌层的诱导外，胚胎心内膜还是心脏中其他几种细胞的祖细胞来源。谱系追踪和基因打靶研究表明，胚胎心内膜产生了构成心脏冠状血管的一部分内皮。冠状动脉内皮与其他内皮的不同之处在于：它对血液渗透压具有独特的反应并且具有高的脂肪酸转运能力，适合在高能量需求的器官中发挥作用。除了冠状动脉内皮外，心内膜还产生形成心脏瓣膜的细胞类型:瓣膜内皮细胞(VEC)和瓣膜间质细胞(VIC)。
[0007]除了其独特的功能特性外，心内膜谱系还因其发育起源而与其他内皮群体不同。心内膜谱系是从表达关键的心脏转录因子NKX2
‑
5和第二生心区发育调节因子ISL1的祖细胞群体中特化的。在心内膜发育期间，NKX2
‑
5直接激活对内皮和心内膜谱系发育至关重要的转录因子ETV2。在NKX2
‑5+
细胞池中，ETV2的功能是上调NFATC1表达，进而在心肌细胞命运的代价情况下促进心内膜发育。
[0008]鉴于心内膜谱系在心脏发育中的核心作用，从多能干细胞(PSCs)，例如，人PSCs(hPSCs)中产生这些内皮细胞的能力将为产生用于处理应用的冠状动脉内皮细胞和生物瓣膜、为工程化用于疾病建模和药物筛选的心脏组织，以及为用于研究它们的发育起源提供了新的且潜在的无限内皮细胞来源。

技术实现思路

[0009]使用报告细胞系来鉴定和表征促进NKX2
‑5+
CD31
+
心内膜样群体发育的调控通路。在这些条件下产生的细胞表达了一系列标志物，这些标志物定义了体内心内膜谱系，并证实了诱导小梁命运的能力。在本文所述的对信号转导通路的分析中将BMP10鉴定为该群体的关键调节因子。这些NKX2
‑5+
CD31
+
细胞的特性将其与不存在BMP10情况下产生的hPSC衍生的NKX2
‑5‑
内皮细胞区分开来。
[0010]在一方面，提供了产生心内膜细胞群体的方法。此类方法通常包括提供心血管祖细胞；以及在适当培养条件下，使所述心血管祖细胞与FGF和BMP接触，从而产生心内膜细胞群体，其中所述心内膜细胞群体是表型NKX2
‑5+
和CD31
+
。
[0011]在一些实施例中，心内膜细胞群体是表型GATA4+、GATA5+、NFATC1+、NPR3+和NRG1+。在一些实施例中，心内膜细胞群体是表型ENG(CD105)+。
[0012]在一些实施例中，心血管祖细胞是多能干细胞衍生的心血管祖细胞。在一些实施例中，心血管祖细胞衍生自心血管中胚层细胞。在一些实施例中，心血管祖细胞是人细胞。
[0013]在一些实施例中，BMP选自BMP10和BMP4。在一些实施例中，FGF是bFGF。在一些实施例中，适当培养条件包括不存在VEGF。在一些实施例中，适当培养条件包括不存在Wnt抑制剂。
[0014]在另一方面，提供了通过此类方法制备的心内膜细胞。
[0015]在一些实施例中，此类方法还包括在存在bFGF、BMP2(或BMP4)和TGFβ2的情况下，培养来自心内膜细胞群体的PDGFRb+细胞，从而产生瓣膜间质样细胞(VIC)。在一些实施例中，VIC是表型SOX9+、MSX2+、VIM+、VCAN+、COLIA1+、COL3A1+、POSTN+、CDH11+、NR4A2+、PRRX2+、TIMP3+、RGS5+和ITGA2+。在又一方面，提供了通过此类方法制备的瓣膜间质样细胞(VIC)。
[0016]在另一方面，提供了产生冠状动脉内皮样细胞的方法。此类方法通常包括将本文所述的心内膜细胞与VEGFA接触，然后与VEGFB接触，从而产生冠状动脉内皮样细胞。
[0017]在一些实施例中，此类方法还包括在存在心室心肌细胞情况下，培养心内膜细胞群体，其中心室心肌细胞是表型MYL2(MLC2V)+和CTNT+，从而产生小梁心肌细胞，其中小梁心肌细胞是表型BMP10+、NPPA+、NPPB+、IRX3+、GJA5+、MYL2+和CTNT+。在一些实施例中，培养是在存在VEGFA情况下进行。
[0018]在又一方面，提供了通过此类方法制备的小梁心室心肌细胞，其中小梁心室心肌细胞是表型BMP10+、NPPA+、NPPB+、IRX3+、GJA5+、MYL2+和CTNT+。
[0019]在一方面，提供了补充心肌层中的冠状血管的方法。此类方法通常包括将本文所述的心内膜细胞和/或本文所述的冠状动脉内皮细胞递送至心脏组织，从而补充冠状血管。在一些实施例中，心脏组织是受损的。
[0020]在另一方面，提供了通过补充心肌层来改善心肌细胞移植物的方法。此类方法通常包括递送心室心肌细胞连同本文所述的心内膜细胞和/或本文所述的冠状动脉内皮细胞，从而补充心肌层。在一些实施例中，心脏组织是受损的。
[0021]在又一方面，提供了筛选对心内膜细胞、瓣膜间质样细胞或小梁心肌细胞表现出毒性的测试化合物的方法。此类方法通常包括将本文所述的心内膜细胞、本文所述的瓣膜间质样细胞、本文所述的冠状动脉内皮样细胞和/或本文所述的小梁心室心肌细胞与测试
化合物接触，并鉴定降低任一此类细胞的生存能力的测试化合物。在一些实施例中，测试化合物可以是蛋白质、小分子和核酸。
[0022]在又一方面，提供了产生瓣膜间质样细胞的方法。此类方法通常包括在适当培养条件下，使本文所述的心内膜细胞与BMP2/4和TGFβ2接触，或使本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生心内膜细胞群体的方法，包括：提供心血管祖细胞；以及在适当的培养条件下，使心血管祖细胞与FGF和BMP接触，从而产生心内膜细胞群体，其中所述心内膜细胞群体是表型NKX2
‑
5+和CD31+。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述心血管祖细胞是多能干细胞衍生的心血管祖细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述心血管祖细胞衍生自心血管中胚层细胞。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述心血管祖细胞是人细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述BMP选自BMP10和BMP4。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述FGF是bFGF。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述适当的培养条件包括不存在VEGF。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述适当的培养条件包括不存在Wnt抑制剂。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述心内膜细胞群体为表型GATA4+、GATA5+、NFATC1+、NPR3+和NRG1+。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述心内膜细胞群体为表型ENG(CD105)+。11.通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的心内膜细胞。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：在存在bFGF、BMP2和TGFβ2情况下，培养来自心内膜细胞群体的PDGFRb+细胞，从而产生瓣膜间质样细胞(VIC)，其中VIC是表型SOX9+、MSX2+、VIM+、VCAN+、COLIA1+、COL3A1+、POSTN+、CDH11+、NR4A2+、PRRX2+、TIMP3+、RGS5+和ITGA2+。13.通过权利要求12所述的方法制备的瓣膜间质样细胞VIC。14.一种产生冠状动脉内皮样细胞的方法，包括：使将权利要求1所述的心内膜细胞与a)VEGFA接触，然后与b)VEGFB接触，从而产生冠状动脉内皮样细胞。15.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，还包括，在存在心室心肌细胞情况下，培养心内膜细胞群体，其中所述心室心肌细胞是表型MYL2(MLC2V)+和CTNT+，从而产生小梁心肌细胞，其中所述小梁心肌细胞是表型BMP10+、NPPA+、NPPB+、IRX3+、GJA5+、MYL2+和CTNT+。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述培养在存在VEGFA情况下进行。17.通过权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈登，
申请(专利权)人：大学健康网络，
类型：发明
国别省市：