用于检测核酸的恒温方法、组合物、试剂盒和系统技术方案

本文所述技术针对用于检测靶核酸(例如病毒RNA)的方法、试剂盒、组合物、装置和系统。在一个方面，本文描述了检测靶核酸的方法。在其它方面，本文描述了适用于实践本文所述方法以检测靶核酸的组合物、试剂盒、装置和系统。装置和系统。装置和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测核酸的恒温方法、组合物、试剂盒和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35U.S.C.
§
119(e)，该申请要求2020年4月22日提交的美国临时申请第63/013,818号、2020年5月1日提交的美国临时申请第63/019,018号、2020年5月13日提交的美国临时申请第63/024,084号、2020年6月26日提交的美国临时申请第63/044,513号、2020年6月30日提交的美国临时申请第63/046,400号、2020年9月23日提交的美国临时申请第63/082,019号、2020年10月14日提交的美国临时申请第63/091,528号、2021年1月5日提交的美国临时申请第63/134,010号的权益；其各自内容通过引用的方式以其整体并入本文。
[0003]政府支持
[0004]该专利技术是在美国国家卫生研究院授予的批准号GM133052下的政府支持下完成的。美国政府对该专利技术拥有一定的权利。
[0005]序列表
[0006]本申请包含序列表，该序列表已通过EFS Web以ASCII格式提交，并以此通过引用的方式以其整体并入。上述ASCII副本创建于2021年4月20日，命名为002806
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097400WOPT_SL.txt，且大小为49,222字节。


[0007]本文所述技术涉及用于扩增、检测及鉴别核酸的恒温方法、组合物、试剂盒和系统。

技术介绍

[0008]最近在特定靶标分析物序列的恒温扩增方面的创新，加上结果的可视化读出，已带来了快速、廉价、且易使用的设备的高灵敏度床旁(point
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of
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care，POC)诊断的前景。例如，环介导的恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和解旋酶依赖性恒温DNA扩增(HDA)是可用于检测靶核酸的恒温扩增方法。然而，在许多的这些测定中，扩增子的检测并不特异或灵敏。例如，LAMP通常用于通过将扩增与报告方案耦合来检测样品中是否存在特定的核酸靶标。所述报告方案是可观察到的输出(如颜色变化或荧光发射)，其仅在靶标存在时产生，或与靶标不存在时产生的输出显示出可辨识的差异。用于LAMP的两种最常见的报告方案是比色法输出和荧光输出。在比色法输出中，LAMP反应补充有染料(例如酚红)，该染料会响应于pH的变化而改变颜色。DNA扩增引起溶液pH的变化，肉眼或机器会将其可视为颜色变化。在荧光输出中，LAMP反应补充有条件性荧光DNA结合染料。荧光读数仪检测到DNA扩增子存在时，荧光显著增强。这些报告技术的缺点有两方面。首先，它们不是序列特异性的，并因此任何虚假扩增(所有扩增方案都容易发生)都将会导致假阳性。其次，它们无法根据靶序列产生不同的报告，并因此无法区分多个靶标。
[0009]具有侧向流动装置(LFD)读出的经RPA扩增的DNA检测方案依赖于非DNA信号(例如荧光团或生物素)，最初位于分开的引物上，但在扩增期间聚集在一起。由于RPA容易出错，并且引物“二聚体”或其它非特异性连接使得在LFD上产生阳性信号，因此这些具有固有的
有限特异性。存在多个将RPA产物应用于LFD以快速可视化检测靶扩增子的演示，但它们缺乏以序列特异性方式检查靶扩增子的能力，这将消除RPA背景扩增子的假阳性问题。
[0010]因此，存在对如下的巨大需求：用于在检测期间以最低背景检测靶核酸以及解决上述问题中的一个或多个的方法、组合物和试剂盒。

技术实现思路

[0011]在数个方面，本文提供的组合物和方法部分地基于使用催化探针消化的核酸靶标的序列特异性报告的方案的发现。
[0012]在一个方面，本文提供了用于检测样品中的靶核酸的方法。一般而言，所述方法包括将核酸探针与来自靶核酸扩增的扩增子进行杂交。该探针包含能够产生可检测信号的报告分子。经杂交的核酸探针用双链特异性核酸外切酶(例如，具有5
′
至3
′
核酸外切酶活性的核酸外切酶)进行切割。切割后，对来自经切割的探针的报告分子进行检测。或者或另外，例如用序列特异性方法来检测任何剩余的未切割的核酸探针。
[0013]对核酸探针进行杂交和/或对经杂交的核酸探针进行切割的步骤可以与靶核酸的扩增同时进行。在一些实施方式中，对核酸探针进行杂交和/或对经杂交的核酸探针进行切割的步骤在靶核酸扩增之后进行。
[0014]在一些实施方式中，当核酸探针不与扩增子杂交时，来自报告分子的可检测信号被淬灭。例如，淬灭剂分子可淬灭来自报告分子的可检测信号。因此，在任一方面的一些实施方式中，核酸探针进一步包含能够淬灭由报告分子产生的可检测信号的淬灭剂分子。当核酸探针不与扩增子杂交时，淬灭剂分子可以淬灭来自报告分子的可检测信号。
[0015]可将核酸探针设计为在扩增子的任何位置进行杂交。因此，在任一方面的一些实施方式中，核酸探针可以包含与靶核酸的核苷酸序列和/或用于靶核酸扩增中的引物实质上互补或相同的核苷酸序列。例如，核酸探针可以包含与用于靶核酸扩增中的引物实质上相同的核苷酸序列。在一些实施方式中，核酸探针包含与位于扩增子的内部位置处的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列。
[0016]一般而言，核酸探针与扩增子的单链区域杂交。因此，在一些实施方式中，所述方法进一步包括制备单链扩增子的步骤。例如，靶核酸可以不对称地扩增以产生单链扩增子。在另一非限制性实例中，可以扩增靶核酸以产生双链扩增子和由双链扩增子制备的单链扩增子。本文描述了用于产生单链扩增子的示例性方法。在一些实施方式中，可以扩增靶核酸使得扩增子包含单链区域(例如，LAMP扩增)。
[0017]在任一方面的一些实施方式中，将探针与扩增子进行杂交的步骤是在表面活性剂(例如SDS)和/或能够将单链核酸链杂交/定位至双链核酸的试剂存在下进行的。能够将单链核酸链定位至双链核酸的一些示例性试剂包括但不限于重组酶、单链结合蛋白、Cas蛋白、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)等。
[0018]本文描述的方法可以在装置中进行。例如，本文描述的方法可在包含两个以上腔室的装置中进行。在一些实施方式中，该装置包含用于将流体从第一腔室不可逆转地移动至第二腔室的手段。
[0019]在又一方面，本文提供的组合物包含：具有5
′‑
>3
′
切割活性的核酸外切酶；用于扩增靶核酸的引物组；以及包含报告分子的核酸探针。
[0020]在另一方面，本文提供了用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，该试剂盒包含：具有5
′‑
>3
′
切割活性的核酸外切酶；用于扩增靶核酸的引物组；以及包含报告分子的核酸探针。
[0021]在本文提供的任一方面的一些实施方式中，通过LAMP进行扩增，并且引物组包括正向外引物(F3)、反向外引物(R3)、正向内引物(FIP)和反向内引物(RIP)。在该方面的一些进一步的实施方式中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测样品中来自靶核酸扩增的扩增子的方法，所述方法包括：将核酸探针与来自靶核酸扩增的扩增子进行杂交，其中，所述核酸探针包含与所述靶核酸的核苷酸序列或与用于所述靶核酸扩增中的引物实质上互补或相同的核苷酸序列，其中，所述核酸探针包含能够产生可检测信号的报告分子，并且其中，当所述核酸探针与所述扩增子杂交时，来自所述报告分子的所述可检测信号被部分地淬灭；用具有5'至3'核酸外切酶活性的双链特异性核酸外切酶对经杂交的核酸探针进行切割；以及检测来自经切割的核酸探针的所述报告分子或检测任何剩余的未切割的核酸探针。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述将核酸探针进行杂交或对经杂交的核酸探针进行切割与所述靶核酸的扩增同时进行。3.如权利要求1所述的方法，其中，所述将核酸探针进行杂交或对经杂交的核酸探针进行切割在所述靶核酸的扩增后进行。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述报告分子选自于由以下所组成的组：荧光分子、放射性同位素、生色团、酶、酶底物、化学发光部分、生物发光部分、回声物质、非金属同位素、光学报告分子、顺磁性金属离子和铁磁性金属。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针进一步包含淬灭剂分子。6.如权利要求5所述的方法，其中，当所述核酸探针不与所述扩增子杂交时，所述淬灭剂分子淬灭来自所述报告分子的所述可检测信号。7.如权利要求5所述的方法，其中，当所述核酸探针与所述扩增子杂交时，所述淬灭剂分子淬灭来自所述报告分子的所述可检测信号。8.如权利要求5中任一项所述的方法，其中，所述核酸探针进一步包含至少一个额外的淬灭剂分子。9.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含多个报告分子。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述多个报告分子中的至少两个报告分子是不同的。11.如权利要求1所述的方法，其中，用于所述扩增中的至少一个引物包含能够抑制所述核酸外切酶的5'
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>3'核酸外切酶活性的核酸修饰。12.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含至少一种核酸修饰。13.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含至少一种核酸修饰，所述核酸修饰能够提高用于相对于缺乏所述修饰的核酸探针而与互补链进行杂交的所述核酸探针的熔融温度(Tm)。14.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含能够抑制由聚合酶进行的延伸的至少一种核酸修饰。15.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸外切酶缺乏聚合酶活性。16.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸外切酶具有聚合酶活性。17.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸外切酶选自于由以下所组成的组：Bst全长、Taq DNA聚合酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶VIII、截短的核酸外切酶VIII、λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、RecJf及其任意组合。18.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增为恒温扩增。
19.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增选自于由以下所组成的组：环介导的恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、解旋酶依赖的恒温DNA扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、聚合酶螺旋反应(PSR)、杂交链式反应(HCR)、引物交换反应(PER)、交换反应信号扩增(SABER)、基于转录的扩增系统(TAS)、自我持续序列复制反应(3SR)、单引物恒温扩增(SPIA)和交叉引物扩增(CPA)。20.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增为环介导的恒温扩增(LAMP)。21.如权利要求1所述的方法，其中，所述扩增子为单链的。22.如权利要求21所述的方法，其中，所述方法进一步包括在将所述核酸探针与所述扩增子杂交之前由所述靶核酸制备单链扩增子的步骤。23.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测报告分子包括检测由所述报告分子产生的可检测信号。24.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测报告分子包括荧光检测、发光检测、化学发光检测、比色法检测或免疫荧光检测。25.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测报告分子包括侧向流动测定。26.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含用于配体结合分子的配体。27.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含侧向流动可检测部分。28.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测未切割的核酸探针包括序列特异性检测。29.如权利要求28所述的方法，其中，所述序列特异性检测包括toehold介导的链置换、基于探针的电化学读出、微阵列检测、序列特异性扩增、与缀合的或非缀合的核酸链杂交、比色法测定、凝胶电泳、分子信标、荧光团淬灭剂对、微阵列、测序或其任何组合。30.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测未切割的核酸探针包括侧向流动检测。31.如权利要求1所述的方法，其中，将所述核酸探针固定在表面上。32.如权利要求1所述的方法，其中，将用于所述扩增中的至少一个引物固定在表面上。33.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含与用于所述靶核酸扩增中的引物实质上互补的核苷酸序列。34.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含与用于所述靶核酸扩增中的引物实质上相同的核苷酸序列。35.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含与位于所述扩增子的内部位置处的核苷酸序列实质上互补的核苷酸序列。36.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸探针包含第一核酸链和第二核酸链，其中，所述第一链包含与所述第二链中的区域实质上互补的区域。37.如权利要求36所述的方法，其中，所述第一链和所述第二链彼此连接。38.如权利要求1所述的方法，其中，当与所述扩增子杂交时，所述核酸探针形成发夹结构。39.如权利要求1所述的方法，其中，当与所述扩增子杂交时，所述核酸探针包含单链区域。40.如权利要求1所述的方法，其中，所述检测是至少两个靶核酸的多重检测。41.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法在如下的装置中进行，所述装置包含两个
以上的腔室以及用于将流体从第一腔室不可逆转地移动至第二腔室的手段。42.如权利要求41所述的方法，其中，用于将所述流体从所述第一腔室不可逆转地移动至所述第二腔室的手段可由内置弹簧驱动，所述内置弹簧的势能由螺线管触发器释放。43.如权利要求42所述的方法，其中，所述装置进一步包含用于检测来自所述报告分子的所述可检测信号的手段。44.一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：a)具有5'
‑
>3'切割活性的核酸外切酶；b)用于扩增靶核酸的引物组；以及c)核酸探针，所述核酸探针包含报告分子，其中，所述报告分子能够产生可检测信号，并且其中，所述探针包含与所述靶核酸的核苷酸序列或所述引物组中的引物实质上互补或相同的核苷酸序列。45.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述扩增为LAMP，并且所述引物组包括正向外引物(F3)、反向外引物(R3)、正向内引物(FIP)和反向内引物(RIP)。46.如权利要求45所述的试剂盒，其中，所述引物组进一步包括正向环引物(LF)和反向环引物(LR)。47.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述核酸探针进一步包含淬灭剂分子。48.如权利要求47所述的试剂盒，其中，当所述核酸探针不与互补核酸链杂交时，所述淬灭剂分子淬灭来自所述报告分子的所述可检测信号。49.如权利要求47所述的试剂盒，其中，当所述核酸探针与互补核酸链杂交时，所述淬灭剂分子淬灭来自所述报告分子的所述可检测信号。50.如权利要求47所述的试剂盒，其中，所述核酸探针进一步包含至少一个额外的淬灭剂分子。51.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述核酸探针包含多个报告分子。52.如权利要求51所述的试剂盒，其中，所述多个报告分子中的至少两个报告分子是不同的。53.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述核酸探针包含至少一种核酸修饰，所述核酸修饰能够提高用于相对于缺乏所述修饰的核酸探针而与互补链进行杂交的所述核酸探针的熔融温度(Tm)。54.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述核酸探针包含能够抑制由聚合酶进行的延伸的至少一种核酸修饰。55.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含参考核酸。56.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含用于检测所述报告分子的侧向流动装置。57.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包含用于检测来自所述报告分子的所述可检测信号的手段。58.如权利要求44所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于从所述靶核酸制备双链扩增子的试剂。59.如权利要求44所述的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：金永恩，乔斯林，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：