一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于家禽传染病疫苗制备技术领域，涉及一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白及其应用。本发明专利技术提供的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗原蛋白具有很强的免疫原性，利用所述抗原蛋白制备的亚单位疫苗能够明显增强鸡对C型副鸡禽杆菌的抵抗力，其保护效果优于全菌灭活疫苗，可有效预防C型副鸡禽杆菌的感染。的感染。

【技术实现步骤摘要】
一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于家禽传染病疫苗制备
，具体涉及一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，基本特征为无运动性、菌体呈多形性、强毒株带有荚膜。1932年De Blieck首先报道了自鼻道和鼻窦黏膜具有急性卡他性炎症、面部水肿和结膜炎的鸡群中首次分离出一种革兰氏阴性杆菌。最初的研究报道指出该病原菌生长条件中既需要X(血红素晶)因子，也需要V(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)因子，早期的研究者将其命名为鸡嗜血杆菌(Haemophilus gallinarum)。1962年，Page等人研究发现所有IC病例的分离株生长只需要V因子。因此，有学者提议将只需要V因子的鸡嗜血杆菌命名为一个新种：副鸡嗜血杆菌(H.paragallinarum)，并被广泛接受。近年来，在南非、墨西哥等地已从患鼻炎的鸡中分离到不依赖V因子的副鸡嗜血杆菌菌株。因此，严格按照在体外生长因子需要进行嗜血菌的分类并不科学。2005年，Blackall等将副鸡嗜血杆菌的名称改为副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)。
[0003]副鸡禽杆菌作为鸡的一种重要的呼吸道病原菌，常引起鸡的传染性鼻炎(infectious coryza,IC)，该病在世界范围内广泛传播，给养鸡业造成愈来愈严重的经济损失。目前国内已有许多养鸡场发生该病的报道。从感染部位来看，副鸡禽杆菌感染的是呼吸系统中最前沿的部位——鼻道和鼻窦黏膜，可以说是呼吸道疾病的门户病。这第一屏障被破坏，其他病原的感染率就大大增加。若与其它病原如鸡传染性支气管炎病毒、鸡支原体、鸡传染性喉气管炎等并发感染后引起鸡呼吸道疾病综合征，会给养鸡业造成更大的损失。各种日龄的鸡都易感该菌，常见于13周龄以上的鸡，通常表现为低死亡率和高发病率，产蛋率下降10％～40％。该病病理变化主要表现在上呼吸道急性卡它性炎症，典型症状是黏液性鼻窦炎，鼻窦黏膜水肿充血、黏膜杆状细胞渗出，并且伴随有异噬性白细胞和巨噬细胞，产生典型的鼻炎病变。临床表现为面部单侧或双侧肿胀、流鼻涕、食欲下降、产蛋率下降。
[0004]鸡传染性鼻炎是一种呼吸道传染病，目前主要靠灭活疫苗来控制。灭活疫苗的免疫效果可能与所激发的黏膜抗体相关。研究表明A、B、C三个血清型的副鸡禽杆菌(Apg)均有不同程度的致病力，但三者的灭活菌体不存在型间交叉免疫，只存在型内交叉免疫保护。目前国际上普遍使用的灭活疫苗绝大多数都包含了A型和C型，随着国内外陆续发现有大量B型Apg的流行和发生，国际上影响较大的疫苗公司已经开始提供包含A、B、C三种血清型的三价灭活疫苗。另一方面，由于副鸡禽杆菌含有LPS等毒素物质，大量接种所带来的毒副作用也会影响鸡的产蛋与生长，因此导致了生产上免疫失败时有发生。鸡传染性鼻炎灭活疫苗对野外鸡群感染的预防效果大约为70
‑
80％，在其效力检验中由于环境和评价方法的不尽一致可能会有不同的结果。因此，需要研究更为安全有效的副鸡禽杆菌疫苗，既不影响鸡的
产蛋与生长，又能提高对鸡传染性鼻炎的防疫效果。

技术实现思路

[0005]为弥补现有的副鸡禽杆菌疫苗免疫效果欠佳的不足，本专利技术提供一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，该抗原蛋白的免疫原性强，能够覆盖多种副鸡禽杆菌变异株，利用该抗原蛋白可制备对C型副鸡禽杆菌预防效果显著的亚单位疫苗。
[0006]本专利技术提供的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术还提供一种C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其活性成分包括所述的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。
[0008]优选地，所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白在所述C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗中的终浓度为20μg/ml。
[0009]编码所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因也属于本专利技术的保护范围。
[0010]优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0011]包含所述基因的表达盒也属于本专利技术的保护范围。
[0012]包含所述基因的载体也属于本专利技术的保护范围。
[0013]所述载体可以是克隆载体，包含所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的编码基因以及质粒复制所需的其它元件。所述载体也可以是表达载体，包含所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的编码基因以及能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的编码基因的pET
‑
28a(+)载体。
[0014]包含所述基因的细菌或真菌也属于本专利技术的保护范围。
[0015]所述细菌可以是包含基因克隆载体的细菌，例如E.coli DH5α，通过在适当的条件下培养细菌，使所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的编码基因得到复制；也可以是包含基因表达载体的细菌，例如E.coli BL21(DE3)，通过培养细菌并诱导蛋白表达，获得所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。所述真菌可以是包含基因表达载体的真菌，例如毕赤酵母，通过培养真菌并诱导蛋白表达，获得所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。
[0016]本专利技术还提供所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：合成所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的编码基因；将所述编码基因导入表达载体，得到重组表达载体；将所述重组表达载体导入蛋白表达宿主菌中，得到重组菌；培养所述重组菌，诱导蛋白表达并纯化得到所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。
[0017]所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白在制备C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，将所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白与弗氏佐剂进行等体积混合乳化，制成副鸡禽杆菌亚单位疫苗。在本专利技术的另一些实施例中，所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白还可以与本领域已知的能够作为禽类疫苗的其
它蛋白或灭活菌联用，制备联合疫苗。
[0019]利用本专利技术的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白制备亚单位疫苗并免疫试验鸡群，在C型副鸡禽杆菌攻毒后，所有鸡只没有出现鼻炎症状，保护率为100％；采用全菌常规灭活疫苗(Modesto)免疫试验鸡群，在C型副鸡禽杆菌攻毒后7天内有2
‑
3只鸡出现临床症状，保护率为70
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80％；而PBS对照组的鸡群在攻毒后全部出现鼻炎症状，发病率为100％(表2)。免疫组与对照组的保护率有极显著差异。因此，本专利技术的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白能够明显增强鸡对C型副鸡禽杆菌的抵抗力，针对流行的C型副鸡禽杆菌(如Modesto、H18等菌株)产生免疫保护作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其活性成分包括权利要求1所述的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白。3.根据权利要求2所述的C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗，其特征在于，所述人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白在所述C型副鸡禽杆菌亚单位疫苗中的终浓度为20μg/ml。4.编码权利要求1所述的人工C型副鸡禽杆菌免疫保护性抗原蛋白的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。6.包含权利要求4或5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宏俊，梅晨，徐结，马东梅，张雪，杨胤，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：