一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用，纤维素酶基因序列，如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，纤维素酶的底物结合结构域为PKD

【技术实现步骤摘要】
一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。

技术介绍

[0002]纤维素是地球上含量最丰富、分布最广泛的可再生能源物质。利用微生物来源的纤维素酶将纤维素转化为生物燃料或制备具有高附加产值的工业产品，为缓解当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。然而，现有纤维素酶存在活力低、酶解效率有限、稳定性差、产率低等问题一直制约着纤维素酶的工业化。因此，挖掘新型高效的纤维素酶具有十分重要的意义。尽管利用传统的微生物培养方法已筛选到大量高效产纤维素酶的菌株，但自然环境中的大多数微生物仍不可培养。而宏基因组技术避开了传统的微生物培养方法，直接对所有环境样本中的微生物基因组信息进行研究，打破不可培养微生物的操作壁垒。因此，通过宏基因组技术有望最大限度的挖掘自然界的活性酶基因，获得新颖的纤维素酶。
[0003]纤维素是自然界中储量丰富、价格低廉的可再生生物质原料，对解决全球能源危机问题具有巨大应用潜力，但其结构复杂，难以降解，导致综合利用率较低。现阶段工业化生产生物质能源的主要难点在于高效的纤维素生物质降解酶的匮乏。虽然通过微生物体外培养技术已经筛选出许多优良的纤维素酶基因，但仍有大量不可培养微生物的纤维素酶基因有待挖掘。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。纤维素酶ZFEG1907，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，截短体ZFEG1907t为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域(PKD
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Fn3)余下的催化功能序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，纤维素酶的底物结合结构域基因序列PKD
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Fn3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本实验课题避开传统的微生物直接培养方法，利用宏基因组学技术挖掘研究珠穆拉玛峰土壤宏基因组文库中新颖、高效的纤维素酶基因，将筛选到的纤维素酶基因异源表达及蛋白纯化获得纤维素酶后，接着分析其酶学特性与动力学性质。本研究筛选的新型、高效纤维素酶不仅能丰富现有的纤维素酶资源库，还可为提高木质纤维素利用效率提供参考依据。新纤维素酶SEQ ID NO.1对应的酶蛋白发现，用以催化水解纤维素类降解；另外SEQ ID NO.3有助于底物结合。因此，深入挖掘产纤维素酶基因并实现其高效表达具有非常重要的现实意义。
[0005]实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种纤维素酶基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
[0007]纤维素酶阳性克隆筛选后，纤维素酶阳性亚克隆构建，对阳性亚克隆测序结果使用SnapGene Viewer 4.1.9.0软件进行分析，预测获得一个全长为2118bp的 ORF(核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示)，该序列的GC含量为69％，编码705 个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kDa，预测等电点pI为6.02。将预测的ORF上传到NCBI数据库进行BALSTX同源性比对，结果显示该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第四十四家族(GH44)，且与来源于梨单胞菌科细菌 76.38％的相似性(MBA3515422.1)，与来源于装甲菌门的细菌有73.17％的相似性(MCC2671073.1)，与来源于酸杆菌门的细菌有63.65％的相似性(AHL27901.1)。比对结果表明，该ORF编码的蛋白质是潜在的纤维素酶，命名该基因为 ZFEG1907(核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示)。对该基因编码的纤维素酶 ZFEG1907、GH44家族以及其他GH家族的部分纤维素酶经ClustalW进行多序列比对，并利用MEGA5.1构建系统发育进化树。通过建立进化树，进一步确定 ZFEG1907属于GH44家族。将ZFEG1907序列提交SWISS
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PROT数据库分析蛋白质结构，获得相似度最高的模板3ii1.1，与该模板相比一致性为76.25％，该模板对应的蛋白质为GH44家族纤维素酶celM2(ABL11223.1)
[0008]优选的是，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域余下的催化功能序列，催化功能序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
[0009]上述任一方案中优选的是，所述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列由SEQ IDNO.1所示核苷酸序列去除最后561个碱基对核酸获得。
[0010]本专利技术还公开上述纤维素酶基因的扩增，设计特异性引物zfeg1907
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F和 zfeg1907
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R(引物序列P1907
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F(5
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TTT AAG AAG GAG ATA TAC ATA TGC AGAACC CCG CCG TCAACA TCA
‑3’
)和P1907
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R(5
’‑
GTG GTG GTG GTG GTGGTG CTC GAG TCT CTT AAG AGT TCT GGC GCC CGC
‑3’
)对纤维素酶基因 zfeg1907进行PCR扩增；构建质粒表达蛋白ZFEG1907t使用特异性引物 zfeg1907t
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F和zfeg1907t
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R对纤维素酶基因zfeg1907进行校正PCR扩增；对目的条带回收纯化。
[0011]本专利技术还公开上述纤维素酶基因的诱导表达和纯化方法，包括：
[0012](1)通过在液体LB培养基中加入诱导剂IPTG对重组质粒 pET
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30a(+)
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zfeg1907及pET
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30a(+)
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zfeg1907t进行低温诱导表达；
[0013](2)在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中对重组质粒pET
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30a(+)
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zfeg1907和 pET
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30a(+)
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zfeg1907t进行诱导表达，对目的蛋白进行纯化。
[0014]经过镍柱亲和层析纯化，成功获得纯纤维素酶ZFEG1907及ZFEG1907t。
[0015]本专利技术还公开上述纤维素重组酶活力及稳定性的影响研究，包括以下方法：
[0016](1)温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响；
[0017](2)pH对纤维素重组酶活力和稳定性的影响；
[0018](3)金属离子和化学试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。2.根据权利要求1所述的纤维素酶基因序列，其特征在于：所述核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域余下的催化功能序列，催化功能序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因序列，其特征在于：所述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除最后561个碱基对核酸获得。4.一种纤维素酶的底物结合结构域基因序列，其特征在于：底物结合结构域为PKD
‑
Fn3，PKD
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Fn3...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯治洋，吕云斌，罗浩，范芯瑜，柴树茂，王绍琛，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：