用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型建立方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法，本发明专利技术方法通过病毒感染构建稳定表达β

【技术实现步骤摘要】
用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型建立方法


[0001]本专利技术涉及一种细胞模型的建立方法，尤其涉及用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法。

技术介绍

[0002]人的成纤维细胞生长因子(FGF)包含22个成员，其中FGF19，FGF21和FGF23属于FGF19亚家族，也叫内分泌型FGF。与需要Klotho作为必需辅因子激活FGF信号通路的FGF23不同，FGF19和FGF21需要β
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Klotho辅助因子来增强其与FGF受体(FGFR)的结合能力，进而激活FGF信号通路。FGF19/FGF21与β
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Klotho复合物在体外激活FGFR1c，FGFR2c，和FGFR3c，然而只有FGF19可以激活FGFR4。激活的FGF受体与细胞内信号通路相偶联，主要包括RAS
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MAPK，PI3K
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AKT，PLC,以及STAT通路。FGF19亚家族调控着多种代谢过程，其中FGF19主要抑制肝脏中胆汁酸合成和餐后释放。FGF21主要在肝脏中产生，促进脂肪细胞中脂肪分解，肝脏中的酮体生成；促进葡萄糖摄取，降低血糖。因此，FGF21已成为代谢疾病比如肥胖和二型糖尿病非常有前景的治疗药物。但是FGF19和FGF21作为蛋白类药物有很多不足，所以近年来所需剂量更小，作用时间更长，特异性更高的类似物成为研究热点。
[0003]FGF21类似物类药物评估的过程中可能需要检测其对不同亚型FGFR的激活作用情况。目前检测FGF19/FGF21类似物与不同FGFR结合特异性的方法主要是在细胞中同时转染表达不同亚型的FGFR质粒和β
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Klotho质粒，当使用FGF19/FGF21或其类似物刺激时，通过检测下游磷酸化ERK蛋白的水平评价信号通路的激活情况。这种检测方法由于每次检测不同的药物时都需要重新共转染质粒，可能由于转染效率低，效率不同，转染导致的细胞活力下降及死亡等因素，导致实验重复性差。另外实验操作复杂，无法满足高通量药物检测的需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，解决现有的FGFR特异性鉴定方法存在细胞转染效率、活力低，以及实验重复性差的问题，建立一种能够快速高效检测FGF19/FGF21类似物药物与不同亚型FGFR结合特异性的方法。本专利技术通过病毒感染构建稳定表达β
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Klotho和FGFR的细胞系，筛选并分选出表达阳性的细胞，可以有效解决转染效率低导致的药物响应差的问题。同时，建立的稳转细胞系的细胞活力高，蛋白表达稳定，可以解决瞬转方法导致细胞大量死亡以及重复性较差的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法，包括以下步骤：
[0007](1)含有目的基因β
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Klotho和四种FGFR
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FGFR1c，FGFR2c，FGFR3c，FGFR4慢病毒转移载体的构建：
[0008]应用慢病毒质粒系统，包括psPAX2慢病毒包装质粒，pMD2.G包膜蛋白质粒以及pLVX
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Puro和pLVX
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IRES
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ZsGreen1病毒表达载体。共构建两种病毒表达载体：表达β
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Klotho的pLVX
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Puro
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β
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Klotho表达载体；表达4种FGFR的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR1c，pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR2c，pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR3c，pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR4表达载体。所有质粒分别进行高纯度无内毒素抽提。
[0009](2)表达β
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Klotho的病毒制备：
[0010]在15cm培养皿中培养HEK293T细胞达到汇合度为70％左右，根据转染试剂FuGENE的说明书转染60ul FuGENE转染试剂和8ug psPAX2,4ug pMD2.G和8ug pLVX
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Puro
‑
βKlotho质粒。24h后更换完全培养基，继续培养24h和48h，分别收集包含病毒颗粒的细胞培养液。将两次收集的含病毒的细胞培养液合并。
[0011](3)过表达β
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Klotho的稳定细胞系建立：
[0012]在6孔板中培养L6大鼠成肌细胞，每孔2
×
105个细胞，贴壁后换成含有8ug/ml polybrene的新鲜培养基并加入适量表达β
‑
Klotho病毒颗粒的病毒液，侵染24h后换成完全培养基继续培养。侵染后48h换成含10ug/ml puromycin的培养液筛选一周，待未侵染的对照细胞全部被puromycin杀死即可。扩增有puro抗性的细胞，流式细胞仪检测βKlotho的表达效率，得到L6
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β
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Klotho细胞系。
[0013](4)表达FGFR1c，FGFR2c，FGFR3c，FGFR4的病毒制备：
[0014]分别转染8ug psPAX2,4ug pMD2.G和8ug pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR1c或pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR2c或pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR3c或pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR4质粒于HEK293T细胞中，收集四种病毒液，具体方法与制备表达β
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Klotho的病毒相同。
[0015](5)过表达β
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Klotho和FGFR的稳定细胞的建立：
[0016]在6孔板中培养过表达β
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Klotho的L6细胞即L6
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β
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Klotho细胞，每孔2
×
105个细胞，贴壁后换成含有8ug/ml polybrene的新鲜培养基并加入适量表达FGFR1c，FGFR2c，FGFR3c和FGFR4病毒颗粒的病毒液，侵染24h后换成完全培养基继续培养。
[0017]Humanβ
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Klotho荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测FGF19和FGF21类似物对FGF受体选择特异性的细胞模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有目的基因β
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Klotho和四种慢病毒的转移载体，所述四种慢病毒为FGFR
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FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4；应用慢病毒质粒系统构建病毒表达载体；所述慢病毒质粒系统包括psPAX2慢病毒包装质粒、pMD2.G包膜蛋白质粒、pLVX
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Puro表达载体和pLVX
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IRES
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ZsGreen1表达载体；所述病毒表达载体包括：表达β
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Klotho的pLVX
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Puro
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β
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Klotho表达载体、表达FGFR1c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR1c表达载体、表达FGFR2c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR2c表达载体、表达FGFR3c的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR3c表达载体和表达FGFR4的pLVX
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IRES
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ZsGreen1
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FGFR4表达载体；所有质粒分别进行高纯度无内毒素抽提；(2)表达β
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Klotho的病毒制备：在15cm培养皿中培养HEK293T细胞达到汇合度为70％左右，根据转染试剂FuGENE的说明书转染60ul FuGENE转染试剂和8ug psPAX2,4ug pMD2.G和8ug pLVX
‑
Puro
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β
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Klotho质粒；24h后更换完全培养基，继续培养24h和48h，分别收集包含病毒颗粒的细胞培养液，将两次收集的含病毒的细胞培养液合并；(3)过表达β
‑
Klotho的稳定细胞系建立：在6孔板中培养L6大鼠成肌细胞，每孔2
×
105个细胞，贴壁后换成含有8ug/ml polybrene的新鲜培养基并加入适量表达β
‑
Klotho病毒颗粒的病毒液，侵染24h后换成完全培养基继续培养，侵染后48h换成含10ug/ml puromycin的培养液筛选一周，待未侵染的对照细胞全部被puromycin杀死即可，扩增有puro抗性的细胞，流式细胞仪检测β
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Klotho的表达效率，得到L6
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β
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Klotho细胞系；(4)表达FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4的病毒制备：分别转染8ug psPAX2、4ug pMD2.G和8ug FGFR病毒表达载体于HEK293T细胞中，收集病毒液，具体方法与制备表达β
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Klotho的病毒相同；所述FGFR病毒表达载体为pLVX
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【专利技术属性】
技术研发人员：严中华，刘畅，周瑜，
申请(专利权)人：辉源生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：