一种检测结核分枝杆菌耐药基因的引物组合及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药基因的扩增引物组合及试剂盒。该试剂盒是基于纳米孔测序技术使用的，包含经过设计、筛选、验证得到的20对引物。检测时，使用这些引物混合物，采用多重PCR扩增待测样本DNA，在反应过程中每对引物扩增一段核苷酸序列或整个基因全长序列，然后运用纳米孔测序技术的高通量和长片段读取特点，获得这些基因序列，最后通过生物信息学分析判定待测样本。本发明专利技术方法可以在同一个反应条件下，同时完成对多个基因的扩增与检测，无需培养结核分枝杆菌，能鉴定结核分枝杆菌复合菌群，并检测多种耐药基因，具有多指标、快速、特异性强、灵敏度高等特点。灵敏度高等特点。灵敏度高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测结核分枝杆菌耐药基因的引物组合及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测结核分枝杆菌耐药基因的扩增引物组合及试剂盒。

技术介绍

[0002]目前全球结核病防控面临很大挑战，其病原体称为结核分枝杆菌，具有非常复杂的耐药谱(Daley,Thorac Surg Clin 2019,29:19
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25；Gagneux,Nat Rev Microbiol 2018,16:202
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213)。导致结核病高致死率的两个关键原因：耐多药结核病(MDR
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TB)，为感染的结核分枝杆菌至少对异烟肼和利福平具有耐药性；广泛耐药结核病(XDR
‑
TB)，指感染的结核分枝杆菌，不仅对异烟肼和利福平具有耐药性，而且对至少一种氟喹诺酮类药物和二线抗结核药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素等)具有耐药性(Liang等，Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2021,40:1851
‑
1861)。
[0003]结核分枝杆菌的耐药分析，对于充分诊断和治疗结核病至关重要，而传统的以培养为基础的表型药敏试验(DST)结果往往需要1～3个月的时间。核酸扩增等方法已投入临床使用，但存在局限，比如仅检测已知基因突变热点等；尽管第二代测序技术(NGS)也已广泛应用，但其平台搭建成本高、试剂价格昂贵，且需要专业技术人员进行实验检测，极大地限制了测序技术在结核病领域的推广和应用，特别是结核病防治负担较大的国家和地区(Dicks等,Annu Rev Med 2019,70:1.1
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1.14)。
[0004]纳米孔测序技术是新近发展的一种高通量测序方法，具有低成本、非标记、无碱基偏好性、能跨越重复基因组区域等优势，且能实时获得序列信息(Deamer等,Nat Biotechnol 2016,34:518
‑
524；Wang等,Nat Biotechnol 2021,39:1348
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1365)。该技术属于单分子测序：当DNA碱基通过纳米孔时，使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基；能获取超长碱基序列，读取速度快、数据通量超大、仪器尺寸却可以小至U盘大小。
[0005]在纳米孔测序技术商业化刚起步的2015年，纳米孔测序的单分子准确率仅为60％左右，限制了其在结核分枝杆菌测序方面的应用。虽然后续单分子准确率逐步提升至＞95％，尝试结核分枝杆菌测序获得初步效果(Dippenaar等，J Clin Microbiol,2021,60(1):e00646
‑
21)，但还是存在SNP碱基分辨率问题。得益于近两年纳米孔测序芯片及算法的升级，总体测序产量和质量都有了较大地提升，可以实现＞99％的准确度。如果能对多个耐药基因全长序列进行多重同步扩增，快速富集目标基因，将极大降低实验操作复杂性，提高基因序列分析时效性，同时结合纳米孔测序设备便携性特点，在普通实验环境中即可开展，结核耐药分析也因此将迎来全新突破与应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测多种耐药基因的扩增引物组合及试剂
盒。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于结核分枝杆菌耐药基因检测的专用引物组合，为如下表1所述的20对引物：
[0008]表1特异性扩增引物序列
[0009][0010][0011]本专利技术还同时提供了一种结核分枝杆菌耐药基因的检测试剂盒：包含如上所述的20对引物。
[0012]作为本专利技术的结核分枝杆菌耐药基因的检测试剂盒的改进：还包括Taq聚合酶(多重PCR聚合酶)、缓冲液、高GC增强剂、dNTPs、阳性对照品和阴性对照品。
[0013]本专利技术还同时提供了利用上述检测试剂盒进行的检测结核分枝杆菌耐药基因的方法：
[0014]将20对引物进行混合，得到引物混合物；采用多重PCR扩增待测样本DNA；然后运用纳米孔测序技术的高通量和长片段读取特点，获得每个基因的序列(将每个基因的ATCG序列信息一一读取出来)，最后通过生物信息学分析判定待测样本。
[0015]作为本专利技术的检测结核分枝杆菌耐药基因的方法，包括以下操作步骤：
[0016]1)、对提取后的样本DNA进行多重PCR扩增；
[0017]PCR扩增体系中：包括由20对引物混合而成的多重扩增引物混合物，各引物浓度为100nM～1μM；Taq聚合酶，浓度为0.5～3U/25μL；dNTP，浓度为0.2～1mM；MgCl2，浓度为0.5mM～3mM；高GC增强剂(保障高GC含量DNA模板的扩增性能)，稀释到1
×
；待测样本DNA作为模板；
[0018]扩增程序为98℃，60s；98℃，20s，60℃30s，72℃120s，循环38次；72℃，4min；
[0019]说明：上述PCR扩增产物的序列长度在500
‑
3000bp之间，能够容纳多个基因变异位点甚至整个基因片段；
[0020]2)、对步骤1)所述的扩增产物进行磁珠纯化，再通过连接反应引入标签序列，即每个样本对应唯一一种标签序列；
[0021]说明：数量可以是6～384个标签序列，分别标记6～384个样本；
[0022]对每个样本DNA分别进行上述步骤1)～2)；
[0023]3)、对步骤2)所获得的已标签序列标记的每个样本DNA对应所得的多重PCR扩增产物进行同等质量比的混合；
[0024]4)步骤3)所获得的混合物，采用连接反应加上马达蛋白和测序接头，形成测序文库；
[0025]5)步骤4)所获得的测序文库，加入到纳米孔测序芯片，再装载到测序仪上，上机测序1～24小时；
[0026]6)步骤5)所输出的测序数据，通过测序仪自带软件和开源软件进行碱基识别、序列比对，获得检测结果。
[0027]说明：进一步还可根据测序数据进行耐药分析。
[0028]作为本专利技术的检测结核分枝杆菌耐药基因的方法的进一步改进：
[0029]所述步骤5)中：测序芯片和测序仪器可以有多种选择，其中可选英国牛津纳米孔公司的测序芯片和测序仪器；
[0030]所述步骤6)中：开源软件可以有多种选择，其中可选centrifuge、minimap2、TBProfiler。
[0031]本专利技术采用多重PCR靶向捕获方法结合纳米孔测序技术，可以消除人源基因等非目标基因序列的干扰，同步检测结核分枝杆菌的多个耐药基因。
[0032]本专利技术所采用的多重PCR靶向捕获测序，共含有20个扩增子。这些扩增子序列长度在700
‑
2500bp之间，能够容纳多个基因变异位点甚至整个基因片段。纳米孔测序能完整读取这些扩增子序列，通过简单的数据分析，快速解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于结核分枝杆菌耐药基因检测的专用引物组合，其特征在于为如下所述的20对引物：序号基因名称上游引物序列下游引物序列1gyrBGAACGCGATTCATAGCAGCATCCCATCAGCACGATCTTGTGGTA2Rv0678AACTTCGTACTCCACCACCTTGTTCGATCCAGATCGGTGACATG3atpECACCATTCAGATGCGCAATCAGTCGATGACTTTACGGCCATCTG4eisGTACGTTCATGATGCGCAACCCTGTCAGTCGACGACGGAAAA5inhACACGTCTTTATGTAGCGCGACAATCGAAGCATACGAATACGCCG6rpsAATCATCAAGGTGGCCATGATCCCGATGTCGATGACCTTGACCAT7gyrAGACGTTGTTGTTCCGGTTCATGAACGTAATAGCGGATCAGCTGG8rpsLGTGATCGACGACATCATCACGACCTTCTGTGCCACAGAAGTCTT9katGCACTAAATCGTTGTCCGGCAACCAAGGCCTGGTACAAGCTGAT10furAATCCGCTCATAGATCGGATCCACATCGGAACATACGAAGGCTGA11rplCGAGTCAAGGGTGTGTGTTGTCAGATGACCACCAGCACCTGTTTA12rpoBCTGCGCTATTGTTGGACGTTGACGTCCATGTAGTCCACCTCA13ubiATCGACACGTAGATCATGCCTTGCCAAGTCAACTGAGCTTTCCGT14pncAGCCTAAAGTCATTGTGGCAGTGATGGTTGAAGAGCTACTGTCGG15rrsTCTATGGATGACCGAACCTGGTGGTTTCCCCATTCGGAAATCCT16rrlACTAACCACCCAAAACCGGATCCCAACTCAACGCTTATTTCGCC17embBGCTCAATTGCCCAGCTCCTGTGATGCGGAACTTCGGGAT18whiB7CGTTTCGATGATCGCTCTGAACGCAAGCTGGAACAATACGGATC19hsp65TAGTGCGAAATGACCGAGATGGCCAAAGGTTGCCTACACGACT20tlyAATTTATCGACGACGGGCTATCCTCGTGAAACCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：项光新，郑晓群，唐晨，徐峰，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：