一种乙型流感Mosaic重组蛋白、重组质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种乙型流感Mosaic重组蛋白、重组质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术设计了包含B型Victoria亚系和Yamagata亚系的流感病毒覆盖有最多T细胞表位的乙型流感Mosaic重组蛋白。本发明专利技术还采用昆虫细胞

【技术实现步骤摘要】
一种乙型流感Mosaic重组蛋白、重组质粒及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种乙型流感Mosaic重组蛋白、重组质粒及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，乙型流感对人类公共卫生安全的威胁非常严重，一些严重并发症(如病毒性心肌炎、脑病等)也与乙型流感病毒感染密切相关。流感疫苗是预防流感最有效的手段，目前市售的流感疫苗为三价或四价流感疫苗。三价灭活流感疫苗(TIV)于1970年代后期首次推出，从那时起，它在许多国家被广泛用于预防流感感染。三价疫苗包括包括两种A型毒株(A/H1N1、A/H3N2)和一种B型毒株(B/Victoria或B/Yamagata)。世界卫生组织(WHO)每年两次仔细审查循环流感毒株，并建议将这些毒株纳入TIV，以应对即将到来的北半球和南半球流感季节。虽然乙型流感病毒被归类为单一流感类型，但两种抗原性和基因上不同的谱系共同传播，但是三价流感疫苗仅包括一个B系，因此可能与主要循环系不匹配。在许多国家，TIV的B型流感谱系与循环B谱系之间的不匹配大约每两到四年发生一次，2011
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2019年8个年度中，我国乙型流感流行株在2015
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2016、2017
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2018两个年度与三价流感疫苗所含乙型系别不匹配，使得疫苗的有效性大大降低。WHO在2012年2月提出了关于季节性流感疫苗应包含乙型两个系毒株的建议，并从2013
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2014年北半球流感季节起，开始推荐四价疫苗，包括两种A型毒株(A/H1N1、A/H3N2)和两种B型毒株(B/Victoria、B/Yamagata)，以提高疫苗匹配性。2018
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2019年度我国四价疫苗获批上市，但是该年度乙型流行株与疫苗株抗原性不匹配，提示可能发生了抗原漂移。与甲型流感病毒相比，乙型流感病毒表现出更少的抗原漂移，但它们有效地逃避了人群中存在的病毒中和抗体的识别。现有上市流感疫苗虽然在一定程度上保护广大民众不受季节性流感的威胁，但其有效性取决于疫苗组分和流行毒株的匹配程度，只能对与之相匹的毒株起保护作用，这远远不足以应对不断变异的新型毒株。因此，新型流感疫苗的研制成为当务之急。目前，正在开发的通用流感疫苗(universal influenza vaccine)主要研究策略为：通过研发新佐剂、新抗原、新载体、新免疫策略等使病毒蛋白上的保守性B细胞或T细胞表位得到更多的刺激。
[0003]血凝素(HA)是病毒膜表面糖蛋白，有较好的免疫原性，HA诱导的中和抗体能够在感染的第一时间作用于病毒，与病毒结合，抑制病毒入侵细胞。因此HA一直是研发流感疫苗的关键抗原，研究人员将HA进行多种修饰作为免疫原，如删除HA的头部，或去除HA茎部片段，或设计嵌合HA，或对HA寡聚糖基进行修饰；采用各种活病毒载体、DNA载体、VLP等系统表达修饰未修饰的HA，并采用不同的免疫策略如“初免
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加强”等，甚至与流感病毒或传统流感疫苗联合使用，刺激机体产生广谱中和抗体，从而获得广谱的免疫保护效果。以上各种尝试为新型流感疫苗的研制奠定了坚实基础，并进一步确定诱导广谱且高效价中和抗体作为新型流感疫苗的研究方向。
[0004]马赛克(Mosaic)疫苗设计的初衷是用于人类免疫缺陷病毒1型(HIV
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1)的防治。尽
管科学家们都在夜以继日的研制对抗艾滋病的法宝，但由于HIV
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1的快速进化能力和多样性，致使至今没有良好的疫苗和药物用于防治艾滋病。而Mosaic疫苗就是基于病毒基因的多样性，从大量的天然序列中组合出一条镶嵌蛋白代替或代表所有天然序列，通过人工优化后制备的疫苗，可以诱导机体产生更广泛的保护。按此方法设计的Mosaic序列，不仅仅适用于HIV，也适用于其他变异较快的病原体，如流感病毒。Kamlangdee等人构建了表达H5N1Mosaic HA的重组安卡拉痘病毒疫苗(MVA
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H5M)，用哺乳动物(小鼠和恒河猴)来评价其对人的保护效果，结果显示，该疫苗能对不同clade的H5 AIV提供保护，并引起机体对HIN1的交叉保护效果。由此可加，以Mosaic方法为核心设计出的涵盖最多T细胞表位的抗原序列具有制作新型疫苗的潜力，可以诱导机体产生更广泛的保护。
[0005]早在上世纪就研制出的病毒样颗粒(virus
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like particles，VLPs)是利用病毒结构蛋白生成的一种纳米级支架，在很多方面都类似于病毒，最重要的区别是VLPs不含有遗传物质，无法在宿主细胞中复制，克服了传统疫苗在安全方面的局限性，可以作为一种新型的疫苗平台。VLPs平台在开发针对人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒以及抗疟疾的疫苗方面取得了相当大的进展，已被批准商品化生产。VLPs可自组装行成20nm至200nm的球形纳米结构，内部不含有病毒遗传物质，不具有感染性和自我复制的能力，因此安全性较高。外观形态上保持天然病毒颗粒的结构，并根据VLPs的表面、大小和形状，以高密度的方式展示抗原表位，从而有效刺激免疫系统。进入机体后与细胞受体结合的过程与病毒感染的过程类似：一方面刺激B细胞介导免疫反应，产生抗体来抵御病毒；一方面以外源病原的途径激发CD4+T细胞,并通过交叉递呈，将病原递呈给CD8+T细胞，介导细胞毒性反应，从而诱导细胞免疫，是一种安全的疫苗形式。以VLP表达系统制备的疫苗具有表达量高、免疫原性强、工艺成熟、制备相对简单、安全性高、副作用小等优点，因此，VLP系统表达修饰后的HA，并通过“初免
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加强”免疫方式诱导广谱中和抗体可能是目前最有希望的通用型流感疫苗发展策略。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种乙型流感Mosaic重组蛋白、重组质粒及其构建方法和应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0008]第一目的，本专利技术提供了一种乙型流感Mosaic重组蛋白，所述乙型流感Mosaic重组蛋白为：
[0009](a)由SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或者，
[0010](b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸组成的蛋白。
[0011]本专利技术将Mosaic疫苗设计方法应用至乙型流感疫苗的构建，结合遗传算法优化蛋白序列，通过对共计35811株不同的乙型流感病毒分离株分析后合成，设计了包含B型Victoria亚系和Yamagata亚系的流感病毒覆盖有最多T细胞表位的乙型流感Mosaic重组蛋白(Mosaic HA序列)，该乙型流感Mosaic重组蛋白的免疫反应效果较佳，交叉保护性好，安全性也较好。
[0012]第二目的，本专利技术提供了一种编码基因，所述编码基因包括针对如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白的编码基因和乙型流感病毒B型M1蛋白的编码基因，其核苷酸
序列分别为SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乙型流感Mosaic重组蛋白，其特征在于，所述乙型流感Mosaic重组蛋白为：(a)由SEQ ID No:1或SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸组成的蛋白。2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因包括针对如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白的编码基因和乙型流感病毒B型M1蛋白的编码基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3～5所示。3.一种包括如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白的重组质粒。4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，将如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白和乙型流感病毒B型M1蛋白分别连接到表达载体中。5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述表达载体包括pFastBac
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Dual载体。6.权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，将如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白分别连接至pFastBac
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Dual载体的p10启动子前的多克隆位点中；乙型流感病毒B型M1蛋白连接至pFastBac
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Dual载体的pH启动子后的多克隆位点中。7.包含如权利要求3
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6任一项所述重组质粒的细胞。8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为将如权利要求3
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6任一项所述重组质粒转入大肠杆菌宿主细胞中得到。9.一种乙型流感Mosaic重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将如权利要求1所述的乙型流感Mosaic重组蛋白分别插入pFastBac
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Dual载体的p10启动子前的多克隆位点中，并将乙型流感病毒B型M1蛋白插入pFastBac
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Dual载体的pH启动子后的多克隆位点中，经大肠杆菌DH5α感受态细胞转化，获得pFastBac
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Dual
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HAM
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YAM
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M1、pFastBac
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Dual
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒跃龙，赵天旖，刘雪洁，汪亮亮，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：