CRISPRa和化学诱导联合制备胰岛素分泌细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种诱导间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，所述的方法包括导入载体组合物以激活NeuroD1基因表达，并经过化学诱导，联合诱导获得胰岛素分泌细胞。该方法获得的胰岛素分泌细胞胰岛素的分泌量明显高。获得的胰岛素分泌细胞胰岛素的分泌量明显高。

【技术实现步骤摘要】
CRISPRa和化学诱导联合制备胰岛素分泌细胞的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及采用CRISPRa和化学诱导联合制备胰岛素分泌细胞的方法。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种人体糖代谢失调的代谢性疾病，根本原因是胰岛素分泌的相对或绝对不足。胰岛素分泌细胞移植成为了弥补胰腺和胰岛器官不足的替代性疗法，已经广泛应用于临床前和临床研究，治疗效果也非常理想。因此，研究者专利技术了多种胰岛素分泌细胞的制备方法。在细胞来源上，各诱导方案涉及了胚胎干细胞、诱导多能干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞等。
[0003]而胰岛素分泌细胞的诱导方法则可以归为两类，一是化学诱导法，即用化学试剂诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞，该方法虽然已经被众多研究者完善和优化，但诱导程序仍然相对复杂，而且诱导效率也相对较低；二是遗传诱导法，即将调控胰岛素分泌细胞分化的相关基因直接输入到干细胞中，在有化学诱导或无化学诱导的情况下，诱导细胞分化。该方法虽然能够简化诱导程序，并提高细胞分化效率，缺点则是输入的基因一般只是基因转录变异体的一种，这限制了输入基因对细胞分化的调控。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种CRISPRa和化学诱导联合制备胰岛素分泌细胞的方法，包括利用没有酶活性的Cas9蛋白(dCas9)，在特定选择的gRNA的指导下精准的将转录激活元件定位在基因的启动子区域，激活基因的表达，结合特定诱导剂的化学诱导，有效的激活并上调与胰岛素分泌细胞分化相关的转录因子的表达。本专利技术所述的方法诱导效率显著高于单独使用化学诱导的方法，且采用特定选择的几个sgRNA比单独使用一个sgRNA具有更高的效率，最高效的激活内源基因的表达。同时避免因直接基因输入导致的基因转录变异体缺失的问题。而且，本方法采用了激活转录因子NeuroD1而非Fdx1，也避免了Fdx1单独表达过量导致的肝炎问题。
[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种诱导间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，所述的方法包括导入载体组合物，以激活NeuroD1基因表达，诱导获得胰岛素分泌细胞。
[0006]优选的，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物。
[0007]优选的，所述的间充质干细胞来源于脐带、骨髓、脐血或脂肪。
[0008]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带。
[0009]优选的，所述的间充质干细胞可以为从人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪中筛选提取获得，或者购买成品。
[0010]优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，包括但不限于野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、
驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方式中，由于脐带间充质干细胞来源相对充足、增殖及分化潜能、免疫原性低、遗传稳定和无伦理争议等优势成为用于诱导胰岛素分泌细胞的最佳材料。
[0012]优选的，所述的载体组合物包含：
[0013]A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体，或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体；其中，所述的sgRNA可以相同或不同。
[0014]B)表达融合蛋白MS2
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P65
‑
HSF1的载体；以及，
[0015]C)表达dCas9蛋白的载体。
[0016]优选的，所述的载体组合物还包含包装病毒所需的其他载体。
[0017]优选的，所述的载体为细菌载体、真菌载体或病毒载体。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的载体为噬菌体载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体、牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体等等现有技术中任何可以将遗传物质传送至细胞中的载体。
[0019]优选的，所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO：25、26、27或28中的任一种或两种以上的组合。
[0020]优选的，编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合：
[0021]A)SEQ ID NO：1、2；
[0022]B)SEQ ID NO：3、4；
[0023]C)SEQ ID NO：5、6；
[0024]D)SEQ ID NO：7、8。
[0025]在本专利技术的一个具体实施方式中，将载体组合物导入间充质干细胞后，表达sgRNA和MS2结合位点的载体会转录为sgRNA以及可以与MS2蛋白特异性结合的具有茎环结构的RNA，与另两个载体(表达融合蛋白MS2
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P65
‑
HSF1的载体、表达dCas9蛋白的载体)形成“基因组DNA
‑
dCas9
‑
sgRNA
‑
MS2 binding site
‑
MS2
‑
P65
‑
HSF1”结构的复合体。进而启动转录，并激活NeuroD1基因表达。
[0026]优选的，所述的方法还包括培养导入载体组合物的间充质干细胞的步骤。
[0027]优选的，所述的培养间充质干细胞采用包含胎牛血清的培养基，进一步优选包含胎牛血清的DMEM培养基，其中，优选包含1％
‑
20％，进一步优选2％
‑
10％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)的胎牛血清。
[0028]优选的，所述的方法还包括化学诱导的步骤，优选的，所述的化学诱导使用表皮生长因子、B27、烟酰胺、betacalulin、胰高糖素样肽
‑
1或β
‑
巯基乙醇中的一种或两种以上的组合作为诱导剂。
[0029]优选的，所述的培养基中还包含标记(例如潮霉素)及抗生素(例如嘌呤霉素)。
[0030]所述培养使用的培养基中加入胎牛血清、表皮生长因子、B27、烟酰胺、betacalulin、胰高糖素样肽
‑
1或β
‑
巯基乙醇中的一种或两种以上的组合；优选的，所述的培养基为DMEM培养基。
[0031]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的胎牛血清加入量为培养基的1％
‑
20％，优选2％
‑
10％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20％。
[0032]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的表皮生长因子的加入量为80
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150ng/mL，优选80
‑
100ng/mL或100
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括导入载体组合物，以激活NeuroD1基因表达，诱导获得胰岛素分泌细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的载体组合物包含：A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体，或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体；B)表达融合蛋白MS2
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P65
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HSF1的载体；以及，C)表达dCas9蛋白的载体；优选的，所述的载体为病毒载体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO：25、26、27或28中的任一种或两种以上的组合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合：A)SEQ ID NO：1、2；B)SEQ ID NO：3、4；C)SEQ ID NO：5、6；D)SEQ ID NO：7、8。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的方法，其特征在于，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪。6.根据权利要求1
‑
5任一所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括培养导入载体组合物的间充质干细胞，所述培养使用的培养基中加入胎牛血清、表皮生长因子、B27、烟酰胺、betacalulin、胰高糖素样肽
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1或β
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巯基乙醇中的一种或两种以上的组合；优选的，所述的培养基为DMEM培养基。7.根据权利要求1
‑
6任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊，王旭，林文龙，桂智，
申请(专利权)人：深圳市沃英达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：