同管检测猴痘病毒核酸并分型的试剂盒、方法及其应用技术

本发明专利技术公开了同管检测猴痘病毒核酸并分型的试剂盒、方法及其应用。本发明专利技术使用猴痘病毒高选择性前引物、针对猴痘病毒I型和II型核酸特异性突变的Taqman

【技术实现步骤摘要】
同管检测猴痘病毒核酸并分型的试剂盒、方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，具体涉及同管检测猴痘病毒核酸并分型的试剂盒、方法及其应用。

技术介绍

[0002]猴痘是一种人畜共患病，由猴痘病毒感染引起。猴痘病毒(MPXV)是一种双链DNA病毒，基因组接近200kbp，属于痘病毒科正痘病毒属(OPXV)，与之同属的常见病毒有天花病毒和牛痘病毒等。1980年人类消灭天花，并逐渐停止了天花疫苗接种，而猴痘则成为威胁人类生命健康最严重的病毒。
[0003]猴痘病毒可以分为两个分支：第I进化枝(传统称为刚果型或中非型)和第II进化枝(传统称为西非型)。其中I型猴痘病毒的潜伏期长，死亡风险高达10.6％。2022年5月以来爆发的猴痘疫情主要是由II型猴痘病毒引起，死亡率达3.6％。MPXV感染的确认基于核酸扩增检测(NAAT)，使用实时或常规聚合酶链反应(PCR)，以检测病毒DNA的独特序列。PCR法可单独使用，也可与测序联合使用。几个小组已经开发了经过验证的PCR方案，用于检测OPXV和更具体的MPXV，其中一些方案包括对刚果分支和西非分支的区分。一些方案包括两个步骤，第一步以PCR反应检测OPXV，然后进行第二步，利用PCR反应或测序仪专门检测MPXV1‑5。病毒基因测序法虽然结果更为准确，但是其检测周期长、成本高、对实验室要求高，很难大规模运用临床。所以，qPCR方法更适合临床大规模检测。相对基因测序而言，qPCR方法具有快速、简便、成本低等优势。已有专利报道利用多通道荧光PCR方法，在一管内实现猴痘病毒核酸的检测与分型，由猴痘病毒通用上下游引物和探针、猴痘病毒刚果金分支上下游引物和探针、猴痘病毒西非分支上下游引物和探针形成的组合物完成检测。但其猴痘病毒核酸检测的引物探针设计区域对正痘病毒属的其他病毒缺乏很好的选择性，存在一定的假阳性风险；使用四套引物探针的方案不仅增加了试剂成本，结果判读也更加复杂；未进行口咽拭子样本的测试，而口咽拭子采样在病毒防控的社区筛查中具有重要的实用价值6。
[0004]多通道荧光PCR的技术升级对于提高检测效率也很重要。当前临床使用的PCR检测试剂大多采用PCR缓冲液和酶液分开保存的方式，终端使用时需要现混现用，不仅操作复杂，而且容易引入污染。快速PCR检测技术也是当前分子诊断的重要发展方向，半小时内完成PCR扩增可以极大地提高检测效率。因此，提供快速、高特异、高灵敏、简便易用且低成本的荧光定量PCR检测方法用于快速诊断猴痘病毒并对西非支系和刚果金支系进行分型，对疫情防控具有重要意义。
[0005]1.Li Y,Zhao H,Wilkins K,Hughes C,Damon IK.Real
‑
time PCR assays for the specific detection of monkeypox virus West African and Congo Basin strain DNA.Journal of Virological Methods.2010Oct；169(1):223
–
7.
[0006]2.Schroeder K,Nitsche A.Multicolour,multiplex real
‑
time PCR assay for the detection of human
‑
pathogenic poxviruses.Molecular and Cellular Probes.2010Apr；24(2):110
–
3.
[0007]3.Maksyutov RA,Gavrilova EV,Shchelkunov SN.Species
‑
specific differentiation of variola,monkeypox,and varicella
‑
zoster viruses by multiplex real
‑
time PCR assay.Journal of Virological Methods.2016Oct；236:215
–
20.
[0008]4.Ropp SL,Jin Q,Knight JC,Massung RF,Esposito JJ.PCR strategy for identification and differentiation of small pox and other orthopoxviruses.J Clin Microbiol.1995Aug；33(8):2069
–
76.
[0009]5.Espy MJ,Cockerill III FR,Meyer RF,Bowen MD,Poland GA,Hadfield TL,et al.Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR.J Clin Microbiol.2002Jun；40(6):1985
–
8.
[0010]6.CN114752711A 检测猴痘病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途.

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供快速、简便、特异性高的同管检测猴痘病毒核酸并分型的荧光PCR检测用引物、探针、反应液、检测方法及试剂盒。本专利技术1)使用猴痘病毒高选择性前引物实现与其他正痘病毒的高选择性，2)使用针对猴痘病毒I型和II型核酸特异性突变的Taqman
‑
LNA探针实现两种亚型的特异性检出，通过在分型探针5
’
端修饰不同荧光基团实现PCR一管检测和分型，3)简洁的引物探针设计搭配新型反应液体系可以实现PCR缓冲液与酶液预混后保持长期稳定，极大地简化了终端用户的实验操作，4)本检测试剂可以支持快速PCR程序，搭配中元汇吉EXP160R快速PCR仪可以实现最快23分钟完成核酸扩增，极大地提高了PCR检测效率。
[0012]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案施行：
[0013]第一方面，本专利技术提供一种基于Taqman探针的荧光定量PCR同管检测猴痘病毒核酸并分型的组合物，所述组合物包括：
[0014]猴痘病毒选择性引物MPV
‑
F如序列表中SEQ ID NO.1所示:5
’‑
AATCTGTAGGCCGTGTATCAGCA
‑
3'；或者在SEQ ID NO.1的5
’
端和/或3
’
端有延长的核苷酸片段的一组序列；或者与SEQ ID NO.1的同源性大于85％的一组序列；或者与SEQ ID NO.1的碱基互补的一组序列；
[0015]配对反向引物MPV
‑
R如序列表中SEQ ID NO.2所示:5
’‑
ATAAAGCTCTGTATGATCT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Taqman探针的荧光定量PCR同管检测猴痘病毒核酸并分型的组合物，其特征在于，所述组合物包括：猴痘病毒选择性引物MPV
‑
F如序列表中SEQ ID NO.1所示:5
’‑
AATCTGTAGGCC GTGTATCAGCA
‑
3'；或者在SEQ ID NO.1的5
’
端和/或3
’
端有延长的核苷酸片段的一组序列；或者与SEQ ID NO.1的同源性大于85％的一组序列；或者与SEQ ID NO.1的碱基互补的一组序列；配对反向引物MPV
‑
R如序列表中SEQ ID NO.2所示:5
’‑
ATAAAGCTCTGTATGA TCTTCAACGT
‑
3'；或者在SEQ ID NO.2的5
’
端和/或3
’
端有延长的核苷酸片段的一组序列；或者与SEQ ID NO.2的同源性大于85％的一组序列；或者与SEQ ID NO.2的碱基互补的一组序列；以及，检测猴痘病毒核酸并分型的PCR荧光检测的Taqman
‑
LNA探针，包括猴痘病毒I型、II型的探针：猴痘病毒I型荧光探针MPV
‑
P1如序列表中SEQ ID NO.3所示:5
’‑
TCGTcGGAaCTGTAcACCATAGtACT
‑3’
，其中，探针中小写字母碱基为锁核酸修饰的非天然碱基；或者在所述探针序列的5
’
端和/或3
’
端有延长的核苷酸片段的一组序列，或者与上述序列的同源性大于85％的一组序列；或者与上述序列的碱基互补的一组序列；猴痘病毒II型荧光探针MPV
‑
P2如序列表中SEQ ID NO.4所示:5
’‑
TCGTtGGAgC TGTAaACCATAGcACT
‑3’
，其中，探针中小写字母碱基为锁核酸修饰的非天然碱基；或者在所述探针序列的5
’
端和/或3
’
端有延长的核苷酸片段的一组序列，或者与上述序列的同源性大于85％的一组序列；或者与上述序列的碱基互补的一组序列。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包括检测人源内标基因的引物和探针。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述人源内标基因Actin的引物和探针如下：Actin
‑
F:5
’‑
TGAGTGGCCCGCTACCTC
‑
3'；Actin
‑
R:5
’‑
CCAGTGAGAAAGGGCGCA
‑
3'；Actin
‑
P:5
’‑
CCTCCCTCCTTCCTGGCCTCCCG
‑
3'。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：白金义，陈佳青，董璐，邹涛，陈威，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：