基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程和生物技术领域，具体提供一种基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。具体的，本发明专利技术提出通过利用CRISPR/Cas9技术敲除木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1的同时，定点过表达转录激活因子Xyr1

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物
，具体提供一种基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]植物生物质是转化为生物燃料和生物炼制产品的最丰富的可再生资源。它由木质纤维素组成，木质纤维素的成分主要包括半纤维素、纤维素和木质素。其中，纤维素和半纤维素是在木质纤维素的降解转化的主要有效成分。β
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1,4
‑
木聚糖是半纤维素的主要成分，占每年形成的可再生植物生物量中第二丰富的材料。木聚糖是一种杂多糖，其主链由β
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1,4
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吡喃木糖基残基组成，其上附有D
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葡萄糖醛酸、L
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阿拉伯糖、对香豆酸和阿魏酸等侧基。纤维素是可再生植物生物量最丰富的材料，也是植物生物量中最难降解的物质，并且只能产生D
‑
葡萄糖。
[0004]木聚糖酶在纸浆、造纸、食品和饲料以及纺织工业中的广泛应用。里氏木霉具有典型的木聚糖水解酶系统，主要分泌β
‑
1,4
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木聚糖酶和β
‑
木糖苷酶，可以完全降解木聚糖成更小的可溶性寡聚糖和单糖，如木二糖和D
‑
木糖。其中里氏木霉分泌的两种主要内切β
‑
1,4
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木聚糖酶XYNI和XYNII占总木聚糖酶的90％。XYN3，显示内切
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β
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1,4
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木聚糖酶活性，但也可以显示内切β
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1,3
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木聚糖酶或木葡聚糖/木葡糖聚糖转移酶活性。XYN4不仅具有明显的外活性，而且具有一定的内活性，主要从各种线性低聚木糖和木糖释放D
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木糖。BXLI具有β
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木糖苷酶、α
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阿拉伯糖苷酶、α
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阿拉伯糖苷酶和β
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木糖苷酶活性，还能水解木二糖，从聚合木聚糖中缓慢释放木糖。同时，里氏木霉能产生一种高效的纤维素水解酶混合物，主要纤维素酶及作用过程：内切葡聚糖酶(EG)通过切割聚合物链内无定形区域的纤维素链来发挥作用，用于工业纤维素酶生产，而纤维二糖水解酶(CBH)则在纤维素链末端水解纤维素链，生成纤维二糖。这种二糖然后被β
‑
葡萄糖苷酶(BGL)水解成葡萄糖。
[0005]提升木聚糖酶活或纤维素酶活的方法主要有：基因突变、DNA重组、发酵工艺优化等；通过过表达木聚糖酶或纤维素酶来构建工程菌株是目前提高木聚糖酶活或纤维素酶活的常用方法。然而，单一过表达酶组分只能提高相应一种酶活。因此，需要一种同步提升里氏木霉木聚糖酶和纤维素酶表达水平的方法。

技术实现思路

[0006]为了克服上述技术问题，本专利技术提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。具体的，本专利技术提出通过利用CRISPR/Cas9技术敲除木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1的同时，定点过
表达转录激活因子Xyr1
‑
A824V以同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，具有良好的实际应用之价值。
[0007]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术的第一个方面，提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，所述方法包括利用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1，同时定点过表达转录激活因子Xyr1。
[0009]其中，所述转录激活因子Xyr1包括野生型转录激活因子Xyr1及其突变体，所述突变体具体为Xyr1
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A824V，经研究证明，其对木聚糖酶和纤维素酶基因表达的转录激活作用更强，因此，本专利技术的一个具体实施方式中，所述转录激活因子Xyr1为Xyr1
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A824V。
[0010]具体的，所述方法包括：利用定位敲除ace1的CRISPR/Cas9载体中里氏木霉甘氨酸tRNA间隔两个靶向ace1基因sgRNA的方式，利用内源tRNA的加工方式转录时释放两个sgRNA，继而引导Cas9敲除ace1；同时，在该位点通过构建的分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1
‑
A824V的供体DNA进行同源重组；分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1
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A824V的供体DNA与靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体共转里氏木霉原生质体，获得转化子后用于发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
[0011]本专利技术的第二个方面，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：
[0012](a)制备高活性木聚糖酶和纤维素酶；
[0013](b)高效降解木质纤维素材料。
[0014]其中，所述木质纤维素材料包括秸秆和林木残留物；其中，所述秸秆包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆和稻草秸秆等。
[0015]上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
[0016]上述技术方案提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，利用本专利技术所述方法生产的木聚糖酶和纤维素酶，显著高于出发菌株Q53G；此外，上述技术方案所述方法获得菌株可以在经济的葡萄糖为碳源的条件下生产木聚糖酶和纤维素酶；进一步在致密化预处理秸秆实际处理中的应用，菌株所产的纤维素酶系和木聚糖酶系能够高效降解致密化预处理秸秆底物，其葡萄糖得率相比出发菌株分别提高提高了2.1和0.9倍，木糖得率相比出发菌株分别提高了2.4和0.9倍。本专利技术提供方法能提高木聚糖酶和纤维素酶分泌量，生产成本低，并且该酶系可以高效应用于秸秆以及其他木质纤维素材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。
附图说明
[0017]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0018]图1为本专利技术质粒pFC33ptrA
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5stsgRNA(ace1*2)图谱。
[0019]图2为本专利技术利用CRISPR/Cas9技术对里氏木霉ace1基因编辑提升木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及结果。
[0020]其中：A是CRISPR/Cas9技术对里氏木霉ace1基因编辑的示意图和菌株上下游锚定验证示意图；B是转化子PCR验证结果。
[0021]图3为本专利技术利用CRISPR/Cas9技术获得菌株在纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，其特征在于，所述方法包括利用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1，同时定点过表达转录激活因子Xyr1；其中，所述转录激活因子Xyr1包括野生型转录激活因子Xyr1及其突变体，所述突变体为Xyr1
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A824V。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用定位敲除ace1的CRISPR/Cas9载体中里氏木霉甘氨酸tRNA间隔两个靶向ace1基因sgRNA的方式，利用内源tRNA的加工方式转录时释放两个sgRNA，继而引导Cas9敲除ace1；同时，在该位点通过构建的分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1
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A824V的供体DNA进行同源重组；分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1
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A824V的供体DNA与靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体共转里氏木霉原生质体，获得转化子后用于发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述方法包括：S1、设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒；S2、构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体；S3、构建定点过表达xyr1
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A824V的供体DNA；S4、将步骤S2制得的靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体与定点过表达xyr1
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A824V的供体DNA共转里氏木霉中获得里氏木霉工程菌；S5、对步骤S4获得的里氏木霉工程菌进行发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒的具体方法包括：基因合成以5S rRNA为启动子、包含两个靶向ace1的sgRNA、以里氏木霉编码甘氨酸的tRNA间隔每个sgRNA并以T6为终止子的sgRNA表达盒，同时在所述sgRNA表达盒两端添加酶切位点；每个sgRNA包含原间隔基序和支架序列；所述酶切位点为Bgl II和Pac I；所述sgRNA表达盒命名为5stsgRNA(ace1*2)，其序列如SEQ ID NO.1所示。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体，具体方法包括：将步骤S1获得的sgRNA表达盒5stsgRNA(ace1*2)与携带Cas9和筛选标记ptrA的自主复制质粒pFC33ptrA酶切后连接在一起，从而构建含有sgRNA(靶向ace1)的CRISPR/Cas9载体，命名为pFC33ptrA
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5stsgRNA(ace1*2)；其中，所述酶切采用Bgl II和Pac I，并使用T
4 DNA连接酶进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟耀华，张佳欣，孙雨，刘红，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：