一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物及应用制造技术

本申请涉及一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物及应用。该引物探针组合物包括组合物1和组合物2；所述组合物1中包括一条通用标签引物和22组分别用于对待检测的15种胃肠道病原体进行检测的引物探针组，所述组合物2中包括一条通用标签引物和17组分别用于对待检测的其他17种胃肠道病原体进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5

【技术实现步骤摘要】
一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物及应用


[0001]本申请涉及分子生物学
，尤其是涉及一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物及应用。

技术介绍

[0002]腹泻是人类尤其是儿童、老人及免疫缺陷者的一种常见传染病和多发病，在婴幼儿疾病死因构成中仅次于呼吸系统疾病。感染性腹泻病因比较复杂，可由病毒、细菌和寄生虫引起。而不同类型的病原体的感染症状类似，但治疗方式和效果存在差异。因此，从临床应用角度来讲，非常有必要针对胃肠道病原体进行并行的排查检测，以准确定位导致感染的病原体种类，便于后续能得到最及时、有效地控制。
[0003]从政策导向层面来讲，2019年5月，国家医保局召开疾病诊断相关分组(DRG)付费国家试点工作启动视频会议，会议公布了DRG付费国家30个试点城市名单，介绍了DRG付费国家试点工作的筹备情况和主要内容。DRG付费在全国的推行势不可挡，其通过统一的疾病诊断分类定额支付标准的制定，达到医疗资源利用标准化，有利于费用控制。DRG(Diagnosis Related Groups，按疾病诊断相关分组)是将患者患病情况进行综合分析后纳入不同的诊断组打包治疗，实现治疗流程的规范化以及治疗费用的可控。一句话概括就是：医保支付方式从“按项目付费”转变到“按病种付费”。
[0004]症候群(Syndrome)，指在某些疾病出现时，经常会同时出现的临床特称、症状、现象，然而实际的病原无法确知。因此，医师为了确认病因，一般会将多种病原的检测联合使用，或者是进行逐一排查。在DRG推行的背景下，累积的高收费限制了多种检测项目的联合使用；而逐一排查则会延长疾病的治疗期，也会有悖于DRG实施的初衷。
[0005]症候群多联检，即把导致相同或相似临床症状的病原体组合在一个检测单元，一次检测即可以得到相关病原体的全部检测结果，即不用因等待单一病原体的依次排查结果而导致治疗周期延长，也不用因同时检测多个项目导致累积费用增加，是可以同时满足临床诊断和控费需求的直接、有效的解决方案。基于肠胃道病原体感染治疗的需求以及国家政策的导向，亟需建立一种可同时检测多种常见腹泻病原体的快速且高效的诊断方法。
[0006]目前临床用于病原体检测方法主要有：培养和分离鉴定、免疫学检测和核酸检测。其中，分离培养需要的周期长，不满足临床急性感染的治疗需求；便捷快速的免疫学检测目前是单品种病原体检测的主要方法，其灵敏度较低，无法使用于早期诊断，且抗原抗体的交叉反应也容易导致假阳性的问题；除了操作层面以及本身特性导致的问题外，上述两种方法也无法用于较多病原体的多联检。与上述两种方法相比，核酸检测不仅由于引物探针的特异性可以避免设计层面的假阳性问题，基因芯片、多重融解曲线法也可以实现较多种病原体的多联检，因此，其在胃肠道感染的症候群检测方面，技术优势明显。与芯片法相比，多重融解曲线法仍然存在实时荧光PCR固有的荧光通道对于重数限制的问题，可以提升的空间有限，仍然需要借助于分孔实现较多重数的检测，因此，分孔带来的成本上升仍然难以回避。现有的基因芯片技术由于灵敏度的限制，主要用在对灵敏度要求不高的方面的筛查，在
对于灵敏度有较高要求的病原体检测方面，应用较少。
[0007]微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。有着体积轻巧、使用样品及试剂量少，且反应速度快、可大量平行处理及可即用即弃等优点的微流控芯片，在生物、化学、医学等领域有着的巨大潜力。
[0008]Biofire公司的FilmArray系统是分子诊断领域症候群多联检的代表性产品，其早在2011年即取得了FDA(Food and Drug Administration，美国食品药品监督管理局)认证，可检测能够引起胃肠道感染的多种病原体靶标。但高额的成本限制了其在国内的应用，迄今为止仍无法通过NMPA(National Medical Products Administration，国家药品监督管理局)的注册来实现推广。目前，取得NMPA认证的胃肠道病原体多联检的产品中，检测的病原体种类有限，主要集中在诺如病毒、轮状病毒A、肠道腺病毒40/41和沙门氏菌与志贺氏菌。如以重庆沃康生物科技有限公司为代表的A群轮状病毒、F组肠道腺病毒40/41型核酸检测试剂盒(PCR
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荧光探针法)，以上海伯杰医疗科技有限公司为代表的诺如病毒核酸检测试剂盒(PCR
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荧光探针法)，以江苏硕世生物科技股份有限公司为代表的沙门氏菌和志贺氏菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。上述方法均为荧光PCR法，需要专门的技术人员在PCR实验室内操作完成，从而限制了其在基层医院中的普及。
[0009]由于现有产品不能兼顾多种病原体的多联检、操作及要求简单(可基层化)、灵敏度及特异性高，而随着医疗机构和需求的进一步下沉，迫切需要一种操作简单(全自动、无人工介入)，涵盖肠胃道感染相关症状的多种病原体，灵敏度、准确度和特异性高，成本可控的综合性能优势明显的产品来满足市场的需要。

技术实现思路

[0010]为了解决现有产品不能兼顾多种病原体的多联检、操作及要求简单、灵敏度及特异性高的缺陷，本申请提供一种新的用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的实现全自动检测的微流控芯片技术平台和配套的试剂盒组合物，利用所述引物探针组合物或试剂盒组合物能够实现32种胃肠道病原体的多重联检，足够覆盖症候群相关病原体，且检测准确性高、灵敏度和特异性好，同时全部检测过程能利用全自动设备自动实现；配合设备可实现检测全过程的自动化，即使基层人员也可以使用；通过多种技术的组合应用保障了操作便捷性、灵敏度、准确度和特异性；且该系统具备产业化转化的能力，成本可控。
[0011]为此，本申请第一方面提供了一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括组合物1和组合物2；所述组合物1中包括一条通用标签引物和22组分别用于对待检测的15种胃肠道病原体(包括常见病毒和细菌)进行检测的引物探针组，所述组合物2中包括一条通用标签引物和17组分别用于对待检测的其他17种胃肠道病原体(细菌和寄生虫)进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5
’
端均连接有所述通用标签引物的核苷酸序列，所述通用标签引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:121所示。
[0012]在一些实施方式中，所述通用标签引物的5
’
端修饰有生物素(biotin)。
[0013]对于多重体系来说，控制不同引物间的竞争干扰，以及抑制引物二聚体的形成是
需要克服的重点内容。前人的研究已经证实，通过引入通用引物的方式，可以较大程度上控制不同引物间的竞争干扰。相关技术中公布了一种检测18种病原体的方法，该方法中采用的是传统的多重体系的设计，并未引入通用引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于胃肠道病原体检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括组合物1和组合物2；所述组合物1中包括一条通用标签引物和22组分别用于对待检测的15种胃肠道病原体进行检测的引物探针组，所述组合物2中包括一条通用标签引物和17组分别用于对待检测的其他17种胃肠道病原体进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5
’
端均连接有所述通用标签引物的核苷酸序列，所述通用标签引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:121所示；优选地，所述通用标签引物的5
’
端修饰有生物素。2. 根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物1中22组分别用于对待检测的15种胃肠道病原体进行检测的引物探针组中的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~66所示；所述组合物2中17组分别用于对待检测的其他17种胃肠道病原体进行检测的引物探针组中的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:67~117所示；优选地，所述探针的5
’
端均修饰有氨基。3. 根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述组合物1和组合物2中还均包括一组针对内参基因的引物探针组，其包括一条针对内参基因的上游引物、一条针对内参基因的下游引物和一条针内参基因的探针；优选地，所述针对内参基因的上游引物、下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:118~120所示；进一步优选地，所述针对内参基因的探针的5
’
端修饰有氨基。4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述待检测的15种胃肠道病原体分别为诺如病毒GI、诺如病毒GII、轮状病毒、肠道腺病毒、星状病毒、札如病毒、沙门氏菌、志贺氏菌、产肠毒素金黄色葡萄球菌、肠道集聚性大肠埃希氏菌、肠道致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠道出血性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌和大肠埃希氏菌O157:H7；所述待检测的其他17种胃肠道病原体分别为空肠弯曲菌、大肠弯曲菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌、阪崎肠杆菌、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌、隐孢子虫、痢疾阿米巴、贾第鞭毛虫和环孢子虫。5.一种用于胃肠道病原体全自动检测的试剂盒组合物，其包括如权利要求1
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4中任意一项所述的引物探针组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒组合物，其特征在于，所述试剂盒组合物包括用于对所述待检测的15种胃肠道病原体进行检测的试剂盒1和用于对所述待检测的其他17种胃肠道病原体进行检测的试剂盒2；所述试剂盒1中包括核酸提取试剂、扩增试剂1和杂交显色试剂1，所述试剂盒2中包括核酸提取试剂、扩增试剂2和杂交显色试剂2；优选地，所述试剂盒1中还包括阳性质控品1和阴性质控品1；所述试剂盒2中还包括阳性质控品2和阴性质控品2。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括裂解液、裂解助剂、核酸助沉剂、磁珠、结合液、漂洗液和洗脱液；优选地，所述裂解液中包括胍盐、表面活性剂和第一缓冲盐；所述裂解助剂为蛋白酶K；所述核酸助沉剂为Carrier RNA；所述磁珠为硅羟基磁珠；所述结合液为异丙醇；所述漂洗液中包括第二缓冲盐和有机醇；所述洗脱液为水；进一步优选地，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述异硫氰酸胍在所述裂解液中的浓度为2~
8M；所述表面活性剂为Triton X
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100，所述Triton X
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100在所述裂解液中的浓度为1~10wt%；所述第一缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述裂解液中的浓度为20~100mM；更进一步优选地，所述第二缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述漂洗液中的浓度为5~20mM；所述有机醇为乙醇，所述乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑾瑾，柳春霞，曾滨，
申请(专利权)人：北京博晖创新生物技术集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：