一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂及试剂盒，具体地，本发明专利技术经过大量的研究获得了灵敏度极高的检测猴痘病毒核酸的PCR扩增试剂，该PCR扩增试剂能够保持冻干前后PCR试剂的性能稳定，因而适合制备冻干PCR试剂，解决了荧光PCR反应试剂配制过程繁琐，配制误差较大，反应重复性不好，产品储存及运输的成本较高的问题。的成本较高的问题。的成本较高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂。

技术介绍

[0002]猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)是全长约为197kb的双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，可导致一种病毒性人畜共患病
‑
猴痘，临床表现主要为发热、皮疹、淋巴结肿大。其既往主要发生在中非和西非，病死率为1％
‑
10％。
[0003]猴痘病毒于1958年在绿猴中被发现，1970年在刚果民主共和国发现首例确诊的人类猴痘病例，此后中非共和国、刚果共和国、尼日利亚等11个非洲国家相继有此病例报道。人类猴痘病例主要分布在非洲中、西部热带雨林地带，非洲以外地区的猴痘疫情较少，且本地传播有限。2022年以来刚果民主共和国、刚果共和国、中非共和国、尼日利亚、喀麦隆5个非洲国家相继报告猴痘病例，且自2022年5月以来，全球已有多个国家报告猴痘确诊病例和疑似病例，波及欧洲、北美洲、南美洲、大洋洲(澳大利亚)和亚洲(阿联酋)，并已发生人际传播。开展猴痘检疫方法的研究，具有重要意义。
[0004]目前对于MPXV的实验室诊断方法主要分为三大类：
[0005]1、分离培养鉴定：通过细胞培养，分离出猴痘病毒。由于进行活毒操作，对实验室生物安全要求极高，且MPXV培养需要一定的时间，不利于快速诊断。
[0006]2、电镜检查：在电镜下发现受检物中是否有与正痘病毒形态一致的病毒存在。该方法需要昂贵的电镜，操作及其复杂，且检测灵敏度不高，样品制备复杂，周期长。
[0007]3、核酸分析法：采用PCR方法检测受检物中是否含有猴痘病毒核酸。尤其是实时荧光定量PCR法，根据猴痘病毒基因组上保守序列设计特异性引物及探针，直接检测猴痘病毒核酸，因而更省时、特异，减少交叉污染，并能精确地对多个样本定量分析。
[0008]常规的PCR试剂包含PCR反应缓冲液、引物、探针、Taq酶、dNTP等，多为液体型试剂，含有对温度敏感的Taq酶、引物、探针等成分，需要低温运输和保存以避免其性状发生变化而失效，且使用过程繁琐，产品储存及运输的成本较高。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂及试剂盒，以解决荧光PCR反应试剂配制过程繁琐，配制误差较大、反应重复性不好，产品储存及运输成本较高的问题。
[0010]本专利技术的第一方面，提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂，所述冻干PCR试剂包括上游引物、下游引物、和探针；其中，所述上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]在另一优选例中，所述探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、CY5、和Texas Red；所述淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、
TAMRA、和MGB。
[0012]在另一优选例中，所述冻干PCR试剂还包括冻干成型剂。
[0013]在另一优选例中，所述冻干成型剂包括选自下组的一种或多种组分：海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、棉子糖、右旋糖酐、甘油、DTT、Proclin 300、甲酰胺和羟丙基
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β
‑
环糊精。
[0014]在另一优选例中，所述冻干成型剂由蔗糖、棉子糖、和羟丙基
‑
β
‑
环糊精组成。
[0015]在另一优选例中，所述冻干成型剂包括：
[0016]蔗糖
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ2‑
10重量份，
[0017]棉子糖
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ2‑
10重量份，和
[0018]羟丙基
‑
β
‑
环糊精
ꢀꢀꢀꢀꢀ2‑
10重量份。
[0019]在另一优选例中，所述冻干成型剂包括：
[0020]海藻糖
ꢀꢀꢀꢀ
3重量份，
[0021]棉子糖
ꢀꢀꢀꢀ
3重量份，和
[0022]蔗糖
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3重量份。
[0023]在另一优选例中，所述冻干PCR试剂还包括选自下组的一种或多种组分：Taq DNA聚合酶、dNTP。
[0024]在另一优选例中，当使用所述冻干PCR试剂配制成PCR反应体系时，所述PCR反应体系中各组分含量为：
[0025][0026]所述PCR反应体系的体积以25μl计。
[0027]在另一优选例中，当使用所述冻干PCR试剂配制成PCR反应体系时，所述PCR反应体系中各组分含量为：
[0028][0029]所述PCR反应体系的体积以25μl计。
[0030]进一步地，所述冻干PCR试剂通过如下冻干程序制备：
‑
50℃，3h；
‑
50℃，0.2mbar，2h；0℃，0.2mbar，1h；10℃，0.2mbar，1h；20℃，0.2mbar，1h；30℃，2h。
[0031]本专利技术的第二方面，提供了一种用于猴痘病毒核酸检测的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的冻干PCR试剂。
[0032]在另一优选例中，所述试剂盒还包括用于复溶所述冻干PCR试剂的复溶剂。
[0033]在另一优选例中，所述复溶剂包括：镁离子、氯化钾、表面活性剂和Tris
‑
HCL。
[0034]在另一优选例中，所述复溶剂包括：1～5mM镁离子、10～100mM氯化钾、0～1％(w/v)表面活性剂和10
‑
100Mm Tris
‑
HCL。
[0035]在另一优选例中，所述复溶剂包括：3mM镁离子、50mM氯化钾、0.05％(w/v)表面活性剂和50mM Tris
‑
HCL。
[0036]在另一优选例中，所述表面活性剂选自下组中的一种或多种：曲拉通X
‑
100、吐温20、NP40。
[0037]在另一优选例中，所述表面活性剂为吐温20。
[0038]本专利技术的第三方面，提供了一种制备用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂的方法，所述方法包括步骤：
[0039](1)配制液体PCR试剂
[0040][0041](2)冻干
[0042]将步骤(1)提供的液体PCR试剂冻干，从而获得所述冻干PCR试剂。
[0043]在另一优选例中，所述步骤(2)中，冻干程序为：
‑
50℃，3h；
‑
50℃，0.2mbar，2h；0℃，0.2mbar，1h；10℃，0.2mbar，1h；20℃，0.2mbar，1h；30℃，2h。
[0044]应理解，在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猴痘病毒核酸检测的冻干PCR试剂，其特征在于，所述冻干PCR试剂包括上游引物、下游引物、和探针；其中，所述上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的冻干PCR试剂，其特征在于，所述探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、CY5、和Texas Red；所述淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、和MGB。3.如权利要求1所述的冻干PCR试剂，其特征在于，所述冻干PCR试剂还包括冻干成型剂。4.如权利要求3所述的冻干PCR试剂，其特征在于，所述冻干成型剂包括选自下组的一种或多种组分：海藻糖、蔗糖、牛血清蛋白、棉子糖、右旋糖酐、甘油、DTT、Proclin 300、甲酰胺和羟丙基
‑
β
‑
环糊精。5.如权利要求4所述的冻干PCR试剂，其特征在于，所述冻干...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖欢欢，马竣，庄志华，赵利兰，王春香，
申请(专利权)人：江苏健为诊断科技有限公司，
类型：发明
国别省市：