一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产药用级聚谷氨酸的培养基和培养方法技术

本发明专利技术涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产药品级聚谷氨酸的新型培养基和培养方法，本发明专利技术确认了枯草芽孢杆菌发酵生产药品级聚谷氨酸种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。利用本发明专利技术提供的培养基配方和发酵生产工艺，药品级聚谷氨酸发酵单位能够达到55g/L，分子量控制在100

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产药用级聚谷氨酸的培养基和培养方法


[0001]本专利技术属于发酵
，特别是涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产药用级聚谷氨酸的培养基和培养方法。

技术介绍

[0002]聚谷氨酸(γ
‑
PGA)是一种由微生物生物合成，它由D
‑
谷氨酸单体或L
‑
谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成。聚谷氨酸是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品，近年来被作为增稠剂，保湿剂，药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料，可通过微生物合成。在生产低聚谷氨酸工艺当中，利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景。微生物发酵法生产聚谷氨酸通常利用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等微生物发酵培养，通过微生物的作用把谷氨酸单体聚合成大分子的聚谷氨酸。
[0003]目前，商业化的聚谷氨酸的生产主要通过微生物深层液体发酵制得，常用的生产菌种枯草芽孢杆菌以味精为主要底物在胞外产生聚谷氨酸。一般而言，枯草芽孢杆菌产生的聚谷氨酸的分子量分布在70
‑
200万。聚谷氨酸分子量在70万应用于化妆品、食品领域；分子量在100
‑
110万应用于药品领域；分子量在150万应用于水处理领域；分子量越大，流变性也就越大，难以被化学试剂修饰，限制了聚谷氨酸的应用。
[0004]目前，国内相关文献报道了采用优化培养基配方、配伍比例和控制关键工艺参数(如温度、pH)来控制聚谷氨酸发酵时的分子量，存在的问题是：
[0005]1国内出口的药用级别聚谷氨酸要求其分子量在控制在100
‑
110万。通过采用优化培养基配方、配伍比例和控制关键工艺参数(如温度、pH)来控制发酵，发酵结束后其分子量很难控制在100
‑
110万，需要在提取过程中采用分解、超滤的方法得到药用级别的聚谷氨酸，才能满足出口条件。由于发酵液中聚谷氨酸分子量未达到要求，导致提取工艺中增加了分解、超滤等工艺步骤，增加了生产成本。
[0006]2国内相关文献公开了聚谷氨酸培养基配方中增加碳源和氮源的单位用量，降低其分子量，增加了发酵成本。
[0007]3国内相关文献报道了使用农作物秸秆经水解后得到的产物作为聚谷氨酸发酵的碳源，如《一种利用农作物秸秆制备聚谷氨酸的新工艺》(CN201610558409.4)公开了采用玉米秸秆进行水解。存在的问题是：玉米秸秆中葡萄糖含量较低，水解后的产物中糖的含量不超过20g/L，浓度较低。
[0008]4聚谷氨酸发酵结束，谷氨酸钠转化率较低，一般在60
‑
75％左右。
[0009]5为了控制聚谷氨酸的分子量，发酵培养结束，聚谷氨酸的发酵单位在30
‑
50g/L，发酵技术水平较低。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效稳定聚谷氨酸分子量(药品级)，降低发酵成本，提高发酵技术水平，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现聚谷氨酸稳定、高效生产的培养基。
[0011]本专利技术第一方面涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产药用级聚谷氨酸的新型培养基：
[0012]包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
[0013]所述一级种子培养基组成为：
[0014]水解液350
‑
400L/m3、谷氨酸钠7
‑
9kg/m3、复合虫粉7
‑
9kg/m3、磷酸氢二钾0.6
‑
0.8kg/m3、硫酸镁0.18
‑
0.2kg/m3、硫酸铵3
‑
5kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3；
[0015]所述二级种子培养基组成为：
[0016]水解液400
‑
450L/m3、谷氨酸钠9
‑
11Kg/m3、复合虫粉5
‑
7kg/m3、发酵菜粕2
‑
4kg/m3、磷酸氢二钾0.6
‑
0.8kg/m3、硫酸镁0.22
‑
0.24kg/m3、硫酸铵4
‑
6kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3；
[0017]所述发酵培养基组成为：
[0018]水解液450
‑
500L/m3、谷氨酸钠9
‑
11Kg/m3、柠檬酸5
‑
7kg/m3、复合虫粉6
‑
8kg/m3、发酵菜粕2
‑
4kg/m3、玉米柠檬酸渣12
‑
14kg/m3、磷酸氢二钾1.8
‑
2kg/m3，硫酸镁0.22
‑
0.24kg/m3，硫酸锌0.003～0.007kg/m3、磷酸二氢钾0.05～0.09kg/m3、硫酸锰0.02～0.04kg/m3、氯化钙0.07
‑
0.11kg/m3,珍珠岩0.3～0.7kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3；
[0019]所述水解液是指甜高粱秸秆根茎与玉米秸秆以4∶1比例混合粉碎后分别过60目筛，按照1∶3
‑
5的比例加入自来水，使用50
‑
60％硫酸调节pH至4.5
‑
5.5，升温至80
‑
90℃，加入C1酶和β
‑
葡糖苷酶，其用量控制在0.1
‑
0.3％。当溶液中得葡萄糖含量超过了100g/L，停止水解。经过滤得到水解液。
[0020]所述复合虫粉是指按照2∶2∶1的比例，将蚯蚓粉、黄粉虫粉、蝗虫粉混合，并过80目筛得到复合虫粉。
[0021]本专利技术第二个方面是涉及一种利用上述培养基生产聚谷氨酸的培养方法。
[0022]所述工艺步骤为：
[0023]1)一级种子培养：首先将种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液接入一级种子培养基中进行培养，OD值1.5
‑
2时移种；
[0024]2)二级种子培养：首先将种子培养基灭菌并冷却至室温，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行培养，OD值1.5
‑
2时移种；
[0025]3)发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至室温，并用无菌空气保压，然后将培养好的二种子培养液移入发酵培养基进行发酵培养，聚谷氨酸发酵单位＞50g/L、分子量为100
‑
110万时停止发酵。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产聚谷氨酸的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中所述一级种子培养基组成为：水解液350
‑
400L/m3、谷氨酸钠7
‑
9kg/m3、复合虫粉7
‑
9kg/m3、磷酸氢二钾0.6
‑
0.8kg/m3、硫酸镁0.18
‑
0.2kg/m3、硫酸铵3
‑
5kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3；所述二级种子培养基组成为：水解液400
‑
450L/m3、谷氨酸钠9
‑
11Kg/m3、复合虫粉5
‑
7kg/m3、发酵菜粕2
‑
4kg/m3、磷酸氢二钾0.6
‑
0.8kg/m3、硫酸镁0.22
‑
0.24kg/m3、硫酸铵4
‑
6kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3；所述发酵培养基组成为：水解液450
‑
500L/m3、谷氨酸钠9
‑
11Kg/m3、柠檬酸5
‑
7kg/m3、复合虫粉6
‑
8kg/m3、发酵菜粕2
‑
4kg/m3、玉米柠檬酸渣12
‑
14kg/m3、磷酸氢二钾1.8
‑
2kg/m3、硫酸镁0.22
‑
0.24kg/m3、硫酸锌0.003～0.007kg/m3、磷酸二氢钾0.05～0.09kg/m3、硫酸锰0.02～0.04kg/m3、氯化钙0.07
‑
0.11kg/m3、珍珠岩0.3～0.7kg/m3、THIX
‑
298微生物发酵消泡剂0.1
‑
0.3L/m3。2.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于所述水解液是指甜高粱秸秆根茎与玉米秸秆以4∶1比例混合粉碎后分别过60目筛，按照1∶3
‑
5的比例加入自来水，使用50
‑
60％硫酸调节pH至4.5
‑
5.5，升温至80
‑
90℃，加入C1酶和β
‑
葡糖苷酶，其用量控制在0.1
‑
0.3％，当溶液中得葡萄糖含量超过了100g/L，停止水解，经过滤得到水解液。3.按照权利要求1所述的培养基，其特征在于所述复合虫粉是指按照2∶2∶1的比例...

【专利技术属性】
技术研发人员：包洁华，张萍，陈德刚，
申请(专利权)人：宁夏泰胜生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：