催化活力提高的α-1，2-岩藻糖基转移酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了催化活力提高的α

【技术实现步骤摘要】
催化活力提高的
α
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1，2
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岩藻糖基转移酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及催化活力提高的α
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1，2
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岩藻糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]岩藻糖基转移酶(FucTs)是一类参与岩藻糖基化寡糖合成的转移酶，可以催化L
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岩藻糖从供体底物GDP
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L
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岩藻糖转移到各种糖受体底物，包括低聚糖、糖蛋白和糖脂等。岩藻糖基化通常是寡糖和糖缀合物生物合成的最后一步，在许多复杂的生理和病理过程中发挥着不可替代的重要作用。
[0003]α
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1,2
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岩藻糖基转移酶(α
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1,2
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FucT，EC 2.4.1.69)属于CAZY家族11，不仅能够催化底物N
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乙酰
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D
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乳糖胺(LacNAc)形成Lewis
X
抗原应用于抗炎症药物和抗肿瘤疫苗，还可催化底物乳糖制备人乳寡糖(HMOs)中重要的益生元2
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岩藻糖基乳糖(2
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FL)。2
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FL占HMOs成分的30％左右，已被美国食品药品管理局(FDA)批准为一般公认安全食品(GRAS)，且被欧盟批准为新食品(NF)。2
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FL的有益特性(例如维持肠道生态平衡、抵抗病原菌的黏附、免疫调节以及促进神经系统发育和修复)促使其在营养保健和药物用途中的潜在应用而受到极大的关注。
[0004]近年来，针对α
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1,2
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FucT的酶源挖掘已逐步深入。许多细菌来源的α
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1,2
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FucT己经被克隆和表征，包括幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、大肠杆菌菌株(Escherichia coli O127:K63(B8)，O128、O86)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)和脆弱拟杆菌(Bacteroidetesfragilis)等。然而，已报道的大部分α
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1,2
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FucT在微生物表达系统中均表现出低催化活力和可溶性表达差等问题，在公开号为CN113528480A的中国专利申请文本中公开了针对幽门螺杆菌Helicobacterpylori NCTC11639来源的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶进行蛋白质改造，第102位的赖氨酸K突变为谷氨酸E、第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C或第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，最终，得到的突变体K102E、R105C、K282E对于天然底物乳糖的催化活力为139mU/mg～174.1mU/mg，虽然催化活力相对野生酶有所提升，但仍较难满足该酶的产业化应用。可见，以上问题已成为该酶产业化应用的技术瓶颈，也极大限制了2
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岩藻糖基乳糖的大规模合成。目前，关于α
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1,2
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FucT定向进化的研究很少报道，通过分子改造提高α
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1,2
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FucT的酶活力、可溶性表达及环境稳定性对该酶技术瓶颈的解决和酶机理的研究及应用均具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]现有技术合成2
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FL的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶存在催化活力低、表达量低、稳定性差等瓶颈问题，限制了该酶的产业化应用和2
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FL的大规模合成。
[0007][技术方案][0008]为了解决上述存在的技术问题，本专利技术通过半理性设计对幽门螺杆菌
Helicobacterpylori ATCC 26695来源的α
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1,2
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岩藻糖基转移酶进行分子改造研究。
[0009]本专利技术旨在利用基因工程手段，通过建立单双点的饱和突变文库、构建含有突变体的2
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FL生产菌株对小型突变库进行初筛、合成供体底物GDP
‑
L
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岩藻糖、对初筛的突变体进行酶活力的复筛。两步筛选后得到催化活力、可溶性表达同时提高的正向突变株，最后选取正向突变位点进行有序叠加，构建组合突变体。该研究方法对糖基转移酶技术瓶颈的解决具有借鉴意义，为2
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FL的批量生产提供了有效途径，并为半理性设计和构建新一代2
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FL微生物细胞工厂提供了新思路，在理论和实际应用方面均具有较重要价值。
[0010]本专利技术的第一个目的是提供催化活力提高的α
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1，2
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岩藻糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生酶的第102位、第105位、第115位、第251位、第255位、第282位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
[0011]在一种实施方式中，所述突变体为以下(a)或(b)：
[0012](a)单点突变体：第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，命名为K102T；或，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，命名为R105C；或，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，命名为D115S；或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，命名为Y251F；或，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为A255G；或，第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，命名为K282E。
[0013](b)组合突变体：第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，命名为K102T/R105C；
[0014]或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，命名为K102T/R105C/D115S；
[0015]或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为Y251F/A255G；
[0016]或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，命名为Y251F/A255G/K282E；
[0017]或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为K102T/R105C/D115S/Y251F/A255G；
[0018]或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.催化活力提高的α
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岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生酶的第102位、第105位、第115位、第251位、第255位、第282位的氨基酸中的一个或多个进行突变。2.如权利要求1所述的α
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1，2
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岩藻糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)或(b)：(a)单点突变体：第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，命名为K102T；或，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，命名为R105C；或，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，命名为D115S；或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，命名为Y251F；或，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为A255G；或，第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，命名为K282E；(b)组合突变体：第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，命名为K102T/R105C；或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，命名为K102T/R105C/D115S；或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为Y251F/A255G；或，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，命名为Y251F/A255G/K282E；或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，命名为K102T/R105C/D115S/Y251F/A255G；或，第102位的赖氨酸K突变为苏氨酸T，第105位的精氨酸R突变为半胱氨酸C，第115位的天冬氨酸D突变为丝氨酸S，第251位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，第255位的丙氨酸A突变为甘氨酸G，第282位的赖氨酸K突变为谷氨酸E，命名为K102T/R105C/D115S/Y251F/A255G/K282E。3.编码权利要求1或2所述α
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岩藻糖基转移酶突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组载体。5.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，李梦丽，江波，李晨晨，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：