鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体制备和应用，属于基因工程技术领域；利用原核表达方法制备得到三种蛋白，制备多克隆抗体并检测其效价和特异性，应用多克隆抗体检测鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275免疫原性和亚细胞定位，制备的多克隆抗体具有特异性和较高的抗体效价，与鸡滑液囊支原体具有良好的反应性，本发明专利技术提供的BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体对鸡滑液囊支原体的检测及相关研究工作具有重要意义，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。益。益。

【技术实现步骤摘要】
鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用。

技术介绍

[0002]鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是家禽致病菌中重要的病原体之一，其发病主要感染鸡的呼吸道、关节等部位，发病时可导致宿主生长速度减慢和产蛋量下降等问题，给世界养鸡业造成了巨大的经济损失。并且病原可长期定植于呼吸道，当机体免疫力下降时扩散至全身，并且与其他禽类疾病协同致病，引发更加严重的症状。
[0003]目前现有技术中较多的制备鸡滑液囊支原体单克隆抗体，仅仅针对一种特定的蛋白，无法针对鸡滑液囊支原体全细胞起特异性，如论文“温政.鸡滑液囊支原体LP78蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[D].山东.山东农业大学2018.06中利用滑液囊支原体上的LP78蛋白作为抗原制备单克隆抗体，但是其免疫反应仅仅针对滑液囊支原体膜表面已知基因序列的LP78蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对上述现有技术存在的问题，提供鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体的制备和应用，通过大肠杆菌表达鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275；制备多克隆抗体；通过ELISA检测多克隆抗体效价，通过Western blot检测多克隆抗体特异性；应用Western blot和免疫荧光实验检测蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体的特异性反应。
[0005]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的，鸡滑液囊支原体蛋白，所述鸡滑液囊支原体蛋白为BMP、RS01790或RS00275；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP优化基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790优化基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列,鸡滑液囊支原体蛋白RS00275优化基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,鸡滑液囊支原体蛋白RS00275氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0006]鸡滑液囊支原体蛋白制备多克隆抗体的方法，所述方法步骤如下：
[0007]步骤S1：利用BMP、RS01790、RS00275三个蛋白的基因分别构建表达菌株BL21(pET28a
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BMP)、BL21(pET28a
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RS01790)、BL21(pET28a
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RS00275)；
[0008]步骤S2：分别对步骤S1中三种表达菌株进行纯化与鉴定得到蛋白BMP、RS01790、RS00275；
[0009]步骤S3：将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275稀释，与等体积的QuickAbody
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Mouse3W佐剂混合，分别在小鼠腿部肌肉内进行免疫，小鼠被饲养在常规动物设施中，自由饮水和进食，最后一次免疫后一周，从免疫小鼠中采集血样离心，得到BMP、RS01790、
RS00275多克隆抗体。
[0010]优选的，所述步骤S1具体如下：将鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275的基因分别进行大肠杆菌密码子优化以及替换终止密码子TGA为TGG；将优化后的基因插入表达载体pET28a分别获得重组表达质粒pET28a
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BMP、pET28a
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RS01790、pET28a
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RS00275；随后将重组表达质粒转化至工程菌大肠杆菌BL21中，挑取单克隆株，通过PCR和测序鉴定，获得三种蛋白的原核表达菌株BL21(pET28a
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BMP)、BL21(pET28a
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RS01790)、BL21(pET28a
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RS00275)。
[0011]优选的，所述步骤S2具体如下：将BL21(pET28a
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BMP)、BL21(pET28a
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RS01790)、BL21(pET28a
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RS00275)接种含有卡那霉素的液体LB培养基中，其中卡那霉素的浓度为25μg/L，37℃震荡培养至OD
600
值为0.7，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导培养4h，离心收集菌体，使用PBS重悬菌体；菌体超声破碎后，在4℃条件下9000rpm/min转速离心10min收集上清，进一步对收集的上清进行纯化；蛋白使用洗脱液洗脱。
[0012]优选的，步骤S3中所述小鼠为雌性6周龄BALB/c小鼠。
[0013]优选的，所述步骤S3中将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275稀释，与等体积的QuickAbody
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Mouse3W佐剂混合，分别在小鼠腿部肌肉内进行免疫，三只免疫小鼠使用的剂量均为50μg/只。
[0014]优选的，所述步骤S3中在小鼠腿部肌肉内进行免疫两次，第一次与第二次免疫间隔2周。
[0015]优选的，所述步骤S3中从免疫小鼠中采集血样37℃温箱放置2h后离心，离心条件为3000rpm/min,15min。
[0016]BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体在鸡滑液囊支原体的检测中的应用。
[0017]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开了鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体制备和应用。结果显示制备的多克隆抗体具有特异性和较高的抗体效价，并且可以应用于Western blot和免疫荧光实验。Western blot检测鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体与鸡滑液囊支原体具有良好的反应性，免疫荧光检测蛋白BMP、RS01790、RS00275可以在鸡滑液囊支原体细胞膜上表达。本专利技术提供的BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体对鸡滑液囊支原体的检测及相关研究工作具有重要意义，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。本专利技术提供的BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体可用于检测鸡滑液囊支原体与蛋白BMP、RS01790、RS00275的功能机制研究。
附图说明
[0018]图1，BL21(pET28a
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BMP)、BL21(pET28a
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RS01790)、BL21(pET28a
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RS00275)的菌液PCR鉴定。
[0019]图2，BMP、RS01790、RS00275蛋白纯化SDS
‑
PAGE鉴定。
[0020]图3，BMP、RS01790、RS00275蛋白Western blot鉴定。
[0021]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鸡滑液囊支原体蛋白，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体蛋白为BMP、RS01790或RS00275；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP优化基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790优化基因如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，鸡滑液囊支原体蛋白RS00275优化基因如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述鸡滑液囊支原体蛋白BMP氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，鸡滑液囊支原体蛋白RS01790氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,鸡滑液囊支原体蛋白RS00275氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.利用权利要求1所述的鸡滑液囊支原体蛋白制备多克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：步骤S1：利用BMP、RS01790、RS00275三个蛋白的基因分别构建表达菌株BL21(pET28a
‑
BMP)、BL21(pET28a
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RS01790)、BL21(pET28a
‑
RS00275)；步骤S2：分别对步骤S1中三种表达菌株进行纯化与鉴定得到蛋白BMP、RS01790、RS00275；步骤S3：将纯化的蛋白BMP、RS01790、RS00275稀释，与等体积的QuickAbody
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Mouse3W佐剂混合，分别在小鼠腿部肌肉内进行免疫，小鼠被饲养在常规动物设施中，自由饮水和进食，最后一次免疫后一周，从免疫小鼠中采集血样离心，分别得到BMP、RS01790、RS00275多克隆抗体。3.根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体蛋白制备多克隆抗体的方法，其特征在于，所述步骤S1具体如下：将鸡滑液囊支原体蛋白BMP、RS01790、RS00275的基因分别进行大肠杆菌密码子优化以及替换终止密码子TGA为TGG；将优化后的基因插入表达载体pET28a分别获得重组表达质粒pET28a
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BMP、pET28a
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RS01790、pET28a
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RS00275；随后将重组表达质粒转化至工程菌大...

【专利技术属性】
技术研发人员：石火英，张桂华，韩乐嘉宝，李权，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：