一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，主要先进行DNA提取，再将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，得到的PCR产物使用3500XL上机进行基因分析，最后计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树，其中DNA提取时取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，3500XL上机是以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配系数不同进行高效快速分离的电泳新技术，替代了传统的琼脂凝胶电泳，分辨率高，灵敏度高，从而提高了菌株的分析质量。从而提高了菌株的分析质量。从而提高了菌株的分析质量。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法


[0001]本专利技术属于结核分枝杆菌分型溯源
，具体涉及一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原体。该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核最多见。结核病是一种古老的疾病，是细菌感染性疾病致死的首位原因。根据对H37Rv标准菌株基因组的分析，获得与人类微卫星样可变数目串联重复序列相对应的位点，大小在52
‑
77bp之间，重复单位的数目可以通过对相应位点的PCR扩增获得。
[0003]在对标准菌株基因组分析时，通常采用琼脂凝胶电泳的方式对各组分之间菌体迁移速度和分配系数不同进行分离，但是，琼脂凝胶电泳的在分离时分辨率低、灵敏度低，从而降低菌珠的分析质量。因此，我们提出一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法来解决上述存在的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，以解决上述
技术介绍
中提出现有技术中不仅工作效率低下，而且浪费大量人力的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，包括如下步骤：
[0007]S1、取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，进行DNA提取，最后
‑
20℃保存备用；
[0008]S2、将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，使用的引物为MIX1、MIX2、MIX3和MIX4，得到PCR产物；
[0009]S3、将PCR产物使用3500XL上机进行基因分析；
[0010]S4、根据基因分析结果对比H37RV标准菌株的串联重复数和扩增片段的大小计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树。
[0011]优选的，步骤S1中所述离心管在80℃水浴30分钟灭活时离心管需拧紧盖防止加热时离心管爆开。
[0012]优选的，步骤S2中所述多重PCR扩增的反应程序如下：
[0013]A1、先在95℃下反应15min；
[0014]A2、在94℃下反应1min；
[0015]A3、在59℃下反应1min；
[0016]A4、在72℃下反应1min30s；
[0017]A5、重复A2
‑
A4的步骤40个周期；
[0018]A6、在72℃下反应10min；
[0019]A7、在4℃保温。
[0020]优选的，所述MIX1的mix为6.25、enhancer为1、ETR
‑
DF为0.5、ETR
‑
DR为0.5、miru26F为0.5、miru26R为0.5、miru40F为0.5、miru40R为0.5、H2O为0.25和DNA为2，所述MIX1的ETR
‑
D引物序列号为GCGCGAGAGCCCGAACTGC(FAM)和GCGCAGCAGAAACGCCAGC，MIX1的miru26引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)，MIX1的miru40R引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)。
[0021]优选的，所述MIX2的mix为6.25、enhancer为1、Miru10F为0.5、Miru10R为0.5、VNTR1955F为0.5、VNTR1955R为0.5、ETR
‑
EF为0.25、ETR
‑
ER为0.25、H2O为1.25和DNA为2，所述MIX2的Miru10引物序列号为GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC和GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT(FAM)，所述MIX2的VNTR1955引物序列号为AGATCCCAGTTGTCGTCGTC(HEX)和CAACATCGCCTGGTTCTGTA，所述MIX2的ETR
‑
E引物序列号为ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA和GTGCCGACGTGGTCTTGAT(TAMRA)。
[0022]优选的，所述MIX3的mix为6.25、enhancer为0.5、VNTR42F为0.5、VNTR42R为0.5、MIRU39F为0.5、MIRU39R为0.5、ETR
‑
AF为0.25、ETR
‑
AR为0.25、H2O为1.25和DNA为2，所述MIX3的VNTR42引物序列号为CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT和GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC(FAM)，所述MIX3的MIRU39引物序列号为CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC和CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT(HEX)，所述MIX3的ETR
‑
A引物序列号为AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT(TAMRA)和CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT。
[0023]优选的，所述MIX4的mix为6.25、enhancer为1、VNTR47F为0.5、VNTR47R为0.5、QUB11bF为0.5、QUB11bR为0.5、QUB26F为0.5、QUB26R为0.5、H2O为0.25和DNA为2，所述MIX4的VNTR47引物序列号为CTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT(FAM)和ACTTGAACCCCCACGCCCATTAGTA，所述MIX4的QUB11b引物序列号为GTAAGGGGGATGCGGGAAAT和GTCGAAGTGAATGGTGGCAT(HEX)，所述MIX4的QUB26F引物序列号为AACGCTCAGCTGTCGGAT(TAMRA)和GCCAGGTCCTTCCCGAT。
[0024]优选的，步骤S3中PCR产物进行基因分析时，具体包括如下步骤：
[0025]B1、样本稀释，将PCR产物稀释100
‑
200倍；
[0026]B2、上机反应体系，将9ul甲酰胺+0.25内参(marker1200LIZ)/孔+稀释后的PCR产物1ul24泳道为一组；
[0027]B3、将稀释后的PCR产物上机操作进行分析；
[0028]B4、最后打开软件Genemaper5分析结果。
[0029]优选的，步骤B2中未有PCR产物的孔也需要补充同体积甲酰胺，用于与含有PCR产物的孔稀释后的PCR产物进行比对。
[0030]优选的，步骤B3中将稀释后的PCR产物进行上机操作的具体操作步骤如下：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、取两环菌置于含有300ul去离子水的1.5ml离心管中，80℃水浴30分钟灭活，再12000rmp离心2分钟，去上清，加入150ulTE缓冲液，振荡悬浮菌沉淀，100℃水浴10分钟，超声15min、12000rmp离心2分钟取上清转至96孔板，进行DNA提取，最后
‑
20℃保存备用；S2、将VNTR12位点分为四组，进行多重PCR扩增，使用的引物为MIX1、MIX2、MIX3和MIX4，得到PCR产物；S3、将PCR产物使用3500XL上机进行基因分析；S4、根据基因分析结果对比H37RV标准菌株的串联重复数和扩增片段的大小计算待测菌株的相对应位点的串联重复数目，再根据VNTR分类数据，构建生成树MST或者NJ树。2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：步骤S1中所述离心管在80℃水浴30分钟灭活时离心管需拧紧盖防止加热时离心管爆开。3.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：步骤S2中所述多重PCR扩增的反应程序如下：A1、先在95℃下反应15min；A2、在94℃下反应1min；A3、在59℃下反应1min；A4、在72℃下反应1min30s；A5、重复A2
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A4的步骤40个周期；A6、在72℃下反应10min；A7、在4℃保温。4.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：所述MIX1的mix为6.25、enhancer为1、ETR
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DF为0.5、ETR
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DR为0.5、miru26F为0.5、miru26R为0.5、miru40F为0.5、miru40R为0.5、H2O为0.25和DNA为2，所述MIX1的ETR
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D引物序列号为GCGCGAGAGCCCGAACTGC(FAM)和GCGCAGCAGAAACGCCAGC，MIX1的miru26引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)，MIX1的miru40R引物序列号为TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC和CATAGGCGACCAGGCGAATAG(HEX)。5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌快速分型溯源方法，其特征在于：所述MIX2的mix为6.25、enhancer为1、Miru10F为0.5、Miru10R为0.5、VNTR1955F为0.5、VNTR1955R为0.5、ETR
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EF为0.25、ETR
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ER为0.25、H2O为1.25和DNA为2，所述MIX2的Miru10引物序列号为GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC和GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT(FAM)，所述MIX2的VNTR1955引物序列号为AGATCCCAGTTGTCGTCGTC(HEX)和CAACATCGCCTGGTTCTGTA，所述MIX2的ETR
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E引物序列号为ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA和GTGCCGACGTGGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄怀，吴敏慧，欧喜超，周杨，
申请(专利权)人：厦门结善生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：