利用基因编辑UC-MSC改善胰岛β细胞功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种促进或改善胰岛β细胞分泌胰岛素的方法，尤其利用基因编辑UC

【技术实现步骤摘要】
利用基因编辑UC
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MSC改善胰岛
β
细胞功能的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学和细胞生物学交叉领域，具体涉及利用基因编辑UC
‑
MSC改善β细胞功能的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)是一种起源于中胚层的多能干细胞，存在于脂肪、骨髓、脐带血和脐带等组织中。脐带血和脐带作为医疗废弃物相比于脂肪等组织，在伦理、成本和提取便捷性上作为MSC的来源途径有着巨大的优势。Shetty等研究表明，脐带中MSC含量远高于脐带血，而且相比于脐带MSC(Umbilical cord MSC，UC
‑
MSC)提取100％的成功率，脐带血MSC的成功率仅为6％。此外，在分化潜能上，UC
‑
MSC不仅具有其它组织来源MSC的分化能力，还保留了一些原始干细胞(胚胎干细胞)的特性，具有更高的分化潜能。
[0003]CRISPRa技术的成熟，使得研究者可以直接激活并上调细胞内源基因表达水平，这为增强MSC的营养供应和免疫调节能力提供了新的方法。2019年，Meng等利用CRISPRa技术上调骨髓MSC中IL10的表达水平，以用于治疗糖尿病小鼠的心肌梗塞，结果显示，经过基因上调表达的MSC的治疗效果明显更好。
[0004]因此，本专利技术提供了一种采用CRISPRa技术上调NGF基因的MSC，并将其用于营养供应与胰岛β细胞共培养，提高了胰岛素的表达量。
专利技术内容
[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种促进胰岛β细胞分泌胰岛素的方法，所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
[0006]优选的，所述的方法包括采用sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点，启动转录，以激活NGF基因表达。
[0007]优选的，所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO：5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
[0008]编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合：
[0009]A)SEQ ID NO：6、7；
[0010]B)SEQ ID NO：9、10；
[0011]C)SEQ ID NO：12、13。
[0012]优选的，所述的方法包括向间充质干细胞中导入载体组合物，以激活NGF基因表达，获得NGF基因过表达的间充质干细胞。
[0013]优选的，所述的载体组合物包括：
[0014]A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体，或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体；其中，所述的sgRNA可以相同或不同，其靶位点选自SEQ ID NO：5、8或11。
[0015]B)表达融合蛋白MS2
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P65
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HSF1的载体；以及，
[0016]C)表达dCas9蛋白的载体。
[0017]优选的，所述的载体组合物还包含包装病毒所需的其他载体。
[0018]优选的，所述的载体为细菌载体、真菌载体或病毒载体。
[0019]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的载体为噬菌体载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体、牛乳头瘤病毒载体、EB病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体等等现有技术中任何可以将遗传物质传送至细胞中的载体。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，将载体组合物导入间充质干细胞后，表达sgRNA和MS2结合位点的载体会转录为sgRNA以及可以与MS2蛋白特异性结合的具有茎环结构的RNA，与另两个载体(表达融合蛋白MS2
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P65
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HSF1的载体、表达dCas9蛋白的载体)形成“基因组DNA
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dCas9
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sgRNA
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MS2 binding site
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MS2
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P65
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HSF1”结构的复合体。进而启动转录，并激活NGF基因表达。
[0021]优选的，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物。
[0022]优选的，所述的间充质干细胞来源于脐带、骨髓、脐血或脂肪。
[0023]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带。
[0024]优选的，所述的间充质干细胞可以为从人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪中筛选提取获得，或者购买成品。
[0025]优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，包括但不限于野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
[0026]优选的，所述的方法还包括培养导入载体组合物的间充质干细胞的步骤。
[0027]优选的，所述的培养间充质干细胞采用包含胎牛血清的培养基，进一步优选包含胎牛血清的DMEM培养基，其中，优选包含1％
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20％，进一步优选2％
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10％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)的胎牛血清。
[0028]优选的，所述的培养基中还包含标记(例如潮霉素)及抗生素(例如嘌呤霉素)。
[0029]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的NGF基因过表达的间充质干细胞的获得方法包括采用上述载体组合物感染间充质干细胞，感染12
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48h(优选24
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32h，例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48)，更换含有标记和/或抗生素的培养基培养。
[0030]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的NGF基因过表达的间充质干细胞的获得方法包括将间充质干细胞接种至DMEM培养基(添加10％胎牛血清)，待细胞密度生长到50％
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90％(优选60％
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80％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％)时，将上述载体组合物转染至细胞中12
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48h(优选24
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32h，例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48)，更换含抗生素的DMEM培养基(10％胎牛血清、400μg/mL潮霉素(Hygromycin)和5μg/mL嘌呤霉素(Puromycin))培养2
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5天(优选3天)。
[0031]优选的，胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞以1：(3
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7)的比例共培养，例如比例可以为1：(3、4、5、6或7)。
[0032]在本专利技术的一个具体实施方式中，胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞以1：5的比例共培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进胰岛β细胞分泌胰岛素的方法，其特征在于，所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括采用sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点，启动转录，以激活NGF基因表达。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO：5、8或11中的任一种或两种以上的组合。4.根据权利要求1
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3任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括向间充质干细胞中导入载体组合物，以激活NGF基因表达，获得NGF基因过表达的间充质干细胞；优选的，所述的载体组合物包括：A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体，或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体；B)表达融合蛋白MS2
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P65
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HSF1的载体；以及，C)表达dCas9蛋白的载体；优选的，所述的载体为病毒载体。5.根据权利要求1
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4任一所述的方法，其特征在于，所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪。6.根据权利要求1
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5任一所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘俊，王旭，林文龙，桂智，
申请(专利权)人：深圳市沃英达生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：