L-泛解酸内酯脱氢酶突变体及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种L

【技术实现步骤摘要】
L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体及其编码基因与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备D
‑
泛解酸内酯中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]D
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泛酸钙又称维生素B5，是辅酶A的组成部分，已经广泛应用于食品、饲料、医药、化工和化妆品等行业。D
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(
‑
)
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泛解酸内酯，也称为(R)
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泛解酸内酯，化学结构为D
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(
‑
)
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泛解酸的γ
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内酯，是合成D
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(+)
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泛酸的关键手性中间体。目前工业化合成D
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泛解酸内酯采用化学法和水解酶拆分法相结合的技术路线，从异丁醛和甲醛为起始原料出发，化学法合成DL
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泛解酸内酯；其中的D
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泛解酸内酯可以被D
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泛解酸内酯水解酶立体选择性水解生成D
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泛解酸，再经内酯化生成D
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泛解酸内酯，留下的L
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泛解酸内酯经化学消旋化为DL
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泛解酸内酯重新循环拆分。
[0003]DL
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泛解酸内酯的拆分是合成D
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泛解酸内酯中的关键步骤。水解酶的手性拆分制备工艺需要L
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泛解酸内酯的消旋，D
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泛解酸和L
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泛解酸内酯的分离以及D
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泛解酸经酸化成环形成D
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泛解酸内酯。水解酶催化的手性拆分法尽管工艺成熟，仍然存在过程复杂、能耗物耗较高、需要消耗较多的酸碱等问题。
[0004]鉴于此，开发更为直接、高效、环保的D
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泛解酸内酯不对称合成方法替代现有的手性拆分技术将具有重要的应用价值。D
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泛解酸内酯可通过氧化还原法不对称合成，该方法可通过两条不同途径实现，第一条途径先以L
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泛解酸内酯脱氢酶催化L
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泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯自发水解形成酮基泛解酸，然后在D
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酮基泛解酸还原酶的作用下生成D
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泛解酸，接着D
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泛解酸在酸的作用下闭环形成D
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泛解酸内酯；更为简捷的第二条途径是以混旋的DL
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泛解酸内酯为底物，利用立体选择性专一的L
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泛解酸内酯脱氢酶催化L
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泛解酸内酯脱氢生成酮基泛解酸内酯，接着酮基泛解酸内酯在D
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酮基泛解酸内酯还原酶催化下不对称生成D
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泛解酸内酯。
[0005]与现有的水解酶催化通路相比，第二条途径工艺更为简单，混旋的底物经生物催化直接得到光学纯产物，不需要消旋步骤，也不需要内酯和酸的分离步骤；因此，第二条途径的氧化还原酶不对称合成D
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泛解酸内酯的方法是一种非常有前景的生物水解酶法替代者。该途径中L
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泛解酸内酯的脱氢是其关键步骤之一，由L
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泛解酸内酯脱氢酶催化。目前已知的L
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泛解酸内酯脱氢酶数量不多，催化性能优异的L
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泛解酸内酯脱氢酶的缺乏限制了氧化还原酶法在不对称合成D
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泛解酸内酯中的应用。研究较多的L
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泛解酸内酯脱氢酶包括源自红串红球菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶和源自星状诺卡氏菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶。源自红串红球菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶在大肠杆菌系统中可溶性表达较差，这一特性加大了多酶组合催化的难度。以红串红球菌L
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泛解酸内酯脱氢酶基因在相同的红串红球菌中增强表达的基因工程菌AKU2103为生物催化剂，催化0.768M的L
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泛解酸内酯脱氢反应144h，反应的转化率为91.9％。考虑到L
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泛解酸内酯脱氢产物为酮基泛解酸内酯，酮基泛解酸内酯容易自发水解为酮基泛解酸。在上述反应144h后，需进一步添加表达了酮基泛解酸还原酶的重组
大肠杆菌为生物催化剂，将产生的酮基泛解酸在还原反应24h后全部转化为D
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泛解酸。最终，D
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泛解酸再经酸化处理生成D
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泛解酸内酯(SiD,Urano N,Nozaki S,et al.L
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Pantoyl lactone dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis:genetic analyses and application to the stereospecific oxidation of L
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pantoyl lactone.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,95:431
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440)。此外，源自星状诺卡氏菌的L
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泛解酸内酯脱氢酶虽然有较详细地酶学性质研究(Kataoka M,Shimizu S,Yamada H.Purification and characterization of a novel FMN
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dependent enzyme:membrane
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bound L
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(+)
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pantoyl lactone dehydrogenase from Nocardia asteroides.European Journal of Biochemistry,1992,204,799
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806)，而其编码基因仍不为人知，阻碍了其在生物催化中的进一步应用。
[0006]目前尚未见源自Rhodococcus opacus的L
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泛解酸内酯脱氢酶的研究，也未见源自Rhodococcus opacus的L
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泛解酸内酯脱氢酶用于多酶级联催化L
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泛解酸内酯手性翻转合成D
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泛解酸内酯的报道。
(三)
技术实现思路

[0007]本专利技术目的是针对现有L
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泛解酸内酯脱氢酶RopLPLDH对L
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泛解酸内酯催化活性不高、催化剂(菌体)用量大问题，提供一种L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备D
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泛解酸内酯中的应用。
[0008]本专利技术采用的技术方案是：
[0009]一种L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第28位进行饱和突变获得。2.如权利要求1所述的L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.编码权利要求1所述的L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体的基因。4.含有权利要求3所述的基因的重组载体。5.含有权利要求3所述的基因的基因工程菌。6.权利要求1所述L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化L
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泛解酸内酯制备酮基泛解酸内酯中的应用。7.权利要求1所述L
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泛解酸内酯脱氢酶突变体在微生物催化制备D
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泛解酸内酯中的应用。8.如权利要求8所述的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，朱芳莹，杨青，张晓健，沈其，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：