一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用，该工程菌通过在酿酒酵母染色体上过表达白藜芦醇合成酶STS、对香豆酰基辅酶A连接酶4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶TAL、肉桂酸

【技术实现步骤摘要】
一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]白藜芦醇（3,4',5
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三羟基二苯乙烯）是一种天然活性物质，是植物体在恶劣环境下或遇到病原体侵害时自身分泌的一种抗毒素，广泛存在于花生、葡萄、虎杖和决明子等天然植物中。近年来的研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、抗肿瘤、抗自由基、保护肝脏、保护心血管、调节免疫、抗病毒、抗细菌及真菌、抗变态反应、辐射保护、预防急性传染性非典型肺炎等功效，可广泛应用于医药、食品、化妆品和保健品等领域，是很有潜力的天然化合物。
[0003]目前白藜芦醇产品根据生产方式分为三种类型，包括植物提取、合成和发酵，每一种类型都有对应的应用行业，包括膳食补充剂、化妆品、食品和饮料等。目前白藜芦醇最主要的生产方法是植物提取法，国外主要是从葡萄皮和葡萄籽中提取，而我国主要从中药材虎杖的根部提取，在市场中占据主导地位。然而白藜芦醇在植物组织中的含量并不高，提取工艺复杂且提取效率低，需要消耗大量的原材料，虎杖的价格较为昂贵，生长周期较长、容易受到气候变化的影响，使得其生产成本和可控性都受到了一定影响。化学合成法合成的白藜芦醇与天然提取的白藜芦醇具有相同的生物活性，能快速大量生产白藜芦醇，满足市场需求，但化学合成法存在合成路线长、生产成本较高、环境污染严重等问题，需要探寻生产成本低且绿色环保的新方法。鉴于植物提取和化学合成各自的缺陷，寻找高产量、低能耗及减少牺牲环境为代价的生物合成方法，尤其是具有易于发酵生产，生产周期短，生产成本低，产物提纯简便，环境污染少等优势的微生物合成法受到了研究者的青睐。近年来，随着微生物代谢工程与合成生物学技术的进步，在微生物中设计与构建高效的异源合成途径，结合工程菌株的大规模发酵是实现白藜芦醇等植物源天然产物工业化生产的重要方法。
[0004]近年来基于微生物细胞工厂生产白藜芦醇的研究取得了诸多进展，如在大肠杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、谷氨酸棒状杆菌等宿主菌中已实现白藜芦醇的异源发酵合成，但仍存在一些亟需解决的问题。值得注意的是，在解除了反馈抑制的前提下，增加解脂耶氏酵母中白藜芦醇异源合成途径的拷贝数，获得了较高的白藜芦醇产量（S
á
ez
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S
á
ez J, Wang G, Marella E R, et al, Engineering the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for high
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level resveratrol production[J], Metabolic Engineering, 2020, 62: 51
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61。但是相比酿酒酵母等模式微生物，对解脂耶氏酵母的系统性研究仍较为有限，不利于进行系统性的代谢途径优化，将限制其对进一步提高白藜芦醇等化合物的发酵产量。
[0005]目前应用广泛的多种模式微生物中，酿酒酵母是第一个被全基因组测序的模式真核生物，属于一般公认安全（GRAS）的菌株，含有内质网、线粒体、液泡等细胞器，为植物源膜蛋白的定位和正确折叠提供了基础，在植物源天然产物的异源合成上具有独特的优势。此外，酿酒酵母具有很高的DNA重组效率，基因编辑技术成熟，重组酿酒酵母工程菌株的设计、
构建和优化具有良好的基础。但目前报道的产白藜芦醇的酿酒酵母工程菌经分批补料发酵后，产量最高仅0.8 g/L（Li M, Schneider K, Kristensen M, et al, Engineering yeast for high
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level production of stilbenoid antioxidants[J], Scientific Reports, 2016, 6(1)），阻碍了高效生物合成白藜芦醇的工业化进程。此外，其他报道的重组酿酒酵母工程菌株的构建或利用苯丙氨酸途径，或利用酪氨酸途径，或通过两个基因实现苯丙氨酸途径和酪氨酸途径的同时利用，尚未有发现利用双功能基因实现白藜芦醇的高效合成的报道。本申请在前人的研究基础上，以新的思路设计和构建了一系列酿酒酵母重组工程菌株，并应用于白藜芦醇的高效合成。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌，为白藜芦醇的高效合成提供新的路径，所述的基因工程菌含有白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶CPR1基因、丙二酰辅酶A合成酶ACC1基因、DAHP合成酶突变体ARO4基因、分支酸变位酶突变体ARO7基因、分支酸合酶ARO2基因、莽草酸激酶AroL基因、乙酰辅酶A合成酶基因ACS，同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6，实现以葡萄糖为底物生物合成白藜芦醇。
[0007]所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶CPR1基因、丙二酰辅酶A合成酶ACC1基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～6所示。
[0008]优选的，所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR、DAHP合成酶突变体ARO4基因、分支酸变位酶突变体ARO7基因、分支酸合酶ARO2基因、莽草酸激酶AroL基因、乙酰辅酶A合成酶基因ACS和丙二酰辅酶A合成酶ACC1基因全部置于酿酒酵母染色体上表达；其中白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL的表达拷贝数≥1个。
[0009]优选的，所述的白藜芦醇合成酶基因STS来源于葡萄（Vitis vinifera）；所述的对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL来源于欧芹（Petroselinum crispum）；所述的苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL来源于红球酵母（Rhodotorula toruloides）；所述的肉桂酸
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羟化酶基因C4H和细胞色素P450酶还原酶基因CPR来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）；所述的乙酰辅酶A合成酶基因ACS来源于沙门氏菌（Salmonella enterica）；所述的DAHP合成酶突变体ARO4基因、分支酸变位酶突变体ARO7基因、分支酸合酶ARO2基因、丙二酰辅酶A合成酶ACC1基因来源于酿酒酵母；所述的莽草酸激酶AroL基因来自大肠杆菌，分别以酿酒酵母、大肠杆菌的基因组为模板通过PCR扩增得到。
[0010]优选的，所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产白藜芦醇的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的工程菌含有白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR1、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1、DAHP合成酶突变体基因ARO4、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶基因ARO2、莽草酸激酶基因AroL、乙酰辅酶A合成酶基因ACS，同时敲除旁路基因CIT2、LPP1、DPP1、PDC6；所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR1、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～6所示。2.根据权利要求1所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL、肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR、DAHP合成酶突变体基因ARO4、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶ARO2基因、莽草酸激酶基因AroL、乙酰辅酶A合成酶基因ACS和丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1全部置于酿酒酵母染色体上表达；其中白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL的表达拷贝数≥1个。3.根据权利要求1所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的白藜芦醇合成酶基因STS来源于葡萄（Vitis vinifera）；所述的对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL来源于欧芹（Petroselinum crispum）；所述的苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL来源于红球酵母（Rhodotorula toruloides）；所述的肉桂酸
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羟化酶基因C4H和细胞色素P450酶还原酶基因CPR来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana）；所述的乙酰辅酶A合成酶基因ACS来源于沙门氏菌（Salmonella enterica）；所述的DAHP合成酶突变体ARO4基因、分支酸变位酶突变体基因ARO7、分支酸合酶基因ARO2、丙二酰辅酶A合成酶基因ACC1来源于酿酒酵母；所述的莽草酸激酶AroL基因来自大肠杆菌，分别以酿酒酵母、大肠杆菌的基因组为模板通过PCR扩增得到。4.根据权利要求3所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的白藜芦醇合成酶基因STS、对香豆酰基辅酶A连接酶基因4CL、苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶基因TAL肉桂酸
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羟化酶基因C4H、细胞色素P450酶还原酶基因CPR、乙酰辅酶A合成酶基因ACS的核苷酸序列根据酿酒酵母密码子偏爱性进行密码子优化后进行合成得到。5.根据权利要求1
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4任一所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用重叠延伸PCR技术或载体构建方法获得各目的基因的表达框，即含启动子
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目的基因
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终止子序列，使得需要表达的基因带有酿酒酵母的组成型强启动子和终止子，并通过PCR技术或载体构建方法获得表达框的DNA片段；（2）利用特异性引物扩增获得目标整合位点上下游300
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1000 bp的同源臂序列，与需要表达的目的基因表达框通过重叠延伸PCR扩增技术连接，获得在酿酒酵母染色体上特定位点整合的基因表达框片段；（3）将营养缺陷筛选标签基因His3、Ura3、Leu2、Lys2与目的基因表达框片段、上下游同
源臂序列连接，并转化到酿酒酵母感受态细胞中，通过同源重组将基因整合到染色体上过表达，然后将酿酒酵母感受态细胞在缺少组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸的缺陷培养基中进行阳性克隆的筛选；或，构建带有能够识别特异性位点的CRISPR
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Cas9质粒，与相应的上下游同源臂序列、目的基因表达框序列共同转化到酿酒酵母感受态细胞中，进行酿酒酵母的基因敲除、整合，在含遗传霉素抗性的平板上进行阳性克隆的筛选；（4）将平板上生长的单菌落接种到YPD液体培养基中，培养16
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36小时，将基因组进行PCR扩增验证，获得高产白藜芦醇的酵母基因工程菌株。6.根据权利要求5所述的高产白藜芦醇的酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述的目的基因表达框是构建于G418质粒上，并通过PCR扩增得到，具体如下：（1）以质粒G418为模板，分别在...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒙丽钧，谢能中，王青艳，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：