一种检测mRNA特异性免疫激活的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种mRNA特异性免疫激活检测方法，其包括下列步骤：制备mRNA：包括，线性化模板制备，体外转录，加帽，线性化模板去除，mRNA纯化；制备iDC细胞，iDC细胞转染，通过电转染或者化学转染将mRNA负载至DC细胞上；iDC诱导mDC：培养，Elispot实验种板；Elispot染色，检测。本发明专利技术主要在于设计了利用Elispot直接检测mRNA特异性免疫激活的方法。本发明专利技术所述方法能够直接检测mRNA特异性免疫激活，具有检测耗时短、便利性高、实验细胞消耗少、检测成本低等优势和特点，可很好地应用于检测mRNA疫苗特异性免疫激活的效果。性免疫激活的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种检测mRNA特异性免疫激活的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术研究领域，具体是涉及一种检测mRNA特异性免疫激活的方法及其应用。

技术介绍

[0002]mRNA疫苗是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译,形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。由于新冠病毒的影响，mRNA疫苗受到更加广泛关注，从1960年mRNA首次被成功提取，到60年后的今天它的价值在传染病疫苗领域以及肿瘤治疗领域发挥重要作用。而针对mRNA特异性免疫激活检测，是检验疫苗安全性和有效性的重要方面。特异性免疫激活分析具体可以对应到细胞免疫的免疫机制的检测和分析。
[0003]细胞免疫的作用机制主要是包括两个方面，致敏T细胞的直接杀伤作用，以及其释放细胞因子的协同杀伤作用。因此常用的mRNA疫苗细胞免疫分析指标也大致可分为T细胞相关表型指标和相关细胞因子分析这两类。免疫学方法直接检测细胞因子的含量，是评价疫苗诱导的细胞免疫应答最常用的检测方法。
[0004]酶联免疫斑点检测(Enzyme
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linked Immunospot Assay，ELISPOT)是将细胞培养技术和ELISA技术相结合，可以原位地检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的一项细胞免疫学检测技术。最常用于疫苗的细胞免疫评价。
[0005]在许多研究中，Elispot技术已被用于免疫动物外周血淋巴细胞中抗原特异的细胞毒性T细胞(CTL)的数量检测。近期，Elispot技术已用于分析和评价从传染病病人的PBMC(外周血单个核细胞，Peripheral blood mononuclear cell)中检测肽特异的T淋巴细胞以及在癌症病人中诱导肿瘤特异的T细胞的疫苗试验。关于癌症病人的新生抗原的免疫原性的检测，文献报道的T细胞免疫功能检测领域上所采用的elispot检测方法一般为体外合成肿瘤特异性全序列短肽作为肽库，负载至抗原呈递细胞树突状细胞(DC)，多肽刺激的树突状细胞与T淋巴细胞混合孵育，检测抗原多肽是否特异性免疫激活，这种方法检测的是多肽的特异性免疫激活效果，缺少直接检测mRNA疫苗的特异性免疫激活效果的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是在于提供一种新的mRNA的特异性免疫激活的检测方法，该方式可以直接检测mRNA疫苗的特异性免疫激活效果。
[0007]本专利技术的第一个方面，是提供了一种检测mRNA特异性免疫激活的方法。
[0008]一种检测mRNA特异性免疫激活的方法，包括下列步骤：
[0009]S100.制备得到纯化后的mRNA；
[0010]S200.收集iDC细胞；
[0011]S300.iDC转染：将纯化后的mRNA转染到iDC细胞中，得到负载表达抗原的mRNA的iDC细胞；
[0012]S400：iDC经诱导分化为mDC培养，获得负载表达抗原的mRNA的mDC细胞；
[0013]S500：Elispot实验种板：将负载表达抗原的mRNA的mDC细胞与淋巴细胞混合，得细胞悬液；
[0014]Elispot的预包被板板孔中加入Elispot专用无血清培养培养基，活化；
[0015]将所述细胞悬液加入活化后的预包被板板孔中。
[0016]S600：进行染色，检测。
[0017]在其中一些实施例中，制备mRNA包括以下步骤：
[0018]S101：线性化模板制备；
[0019]S102：体外转录；
[0020]S103：加帽；
[0021]S104：线性化模板去除；
[0022]S105：mRNA纯化。
[0023]在其中一些实施例中，步骤S300的iDC转染中，mRNA与iDC细胞的比例为：当iDC细胞数约为5
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104个时，mRNA的加入量为0.5μg～5μg，优选为0.8μg～4μg，更优选为1μg～2μg。
[0024]在其中一些实施例中，所述iDC细胞可以从人源的PBMC分离诱导制备，可以从动物例如小鼠分离得到，在其中一个实施例中，优选为从人源的PBMC分离诱导制备得到。
[0025]在其中一些实施例中，iDC细胞转染为通过电转染或者化学转染将mRNA负载至DC细胞上。
[0026]在其中一些实施例中，通过瞬间稳定电转染，转染条件为：脉冲电压200～1500V、脉冲时程5～50ms、脉冲次数1～3次。
[0027]在其中一些实施例中，所述得到负载表达抗原的mRNA的iDC细胞中，mRNA为经过伪尿嘧啶修饰。
[0028]本专利技术的第二目的，是提供上述检测方法在mRNA疫苗特异性免疫激活效果的检测中的应用。
[0029]本专利技术主要在于设计了利用Elispot直接检测mRNA特异性免疫激活的方法。本专利技术检测方法及检测平台将mRNA负载至抗原提呈细胞树突状细胞(DC细胞)中，特别是先iDC细胞转染mRNA，然后由负载表达抗原的mRNA的iDC细胞再诱导mDC培养，在细胞质中翻译形成抗原，从而能够直接验证mRNA表达的肿瘤抗原的特异性免疫激活效果。进一步地，本专利技术通过优化iDC细胞转染mRNA的用量之比，才能很好地激活特异性T细胞，获得相关抗原性的检测结果。
[0030]本专利技术所述方法能够直接检测mRNA疫苗特异性免疫激活效果，具有检测耗时短、便利性高、实验细胞消耗少、检测成本低等优势和特点。
附图说明
[0031]图1是本专利技术实施例1和实施例2中Elispot板孔内斑点的实验图。
[0032]图2是图1的斑点数据统计图。
[0033]图3是本专利技术实施例3中Elispot板的孔内斑点的实验图。
[0034]图4是本专利技术实施例4和5中Elispot板的孔内斑点的实验图。
[0035]图5是本专利技术构建的HCMV抗原表达质粒。
[0036]图6是本专利技术构建的OVA抗原表达质粒。
具体实施方式
[0037]本专利技术下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0038]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。
[0039]本专利技术的术语"包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或组分，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或组分。
[0040]在本专利技术中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测mRNA特异性免疫激活的方法，其特征在于，包括下列步骤：S100.得到纯化后的mRNA；S200.收集iDC细胞；S300.iDC转染：将纯化后的mRNA转染到iDC细胞中，得到负载表达抗原的mRNA的iDC细胞；S400.iDC经诱导分化为mDC培养，获得负载表达抗原的mRNA的的mDC细胞；S500.Elispot实验种板：将负载表达抗原的mRNA的mDC细胞与淋巴细胞混合，得细胞悬液；预包被板板孔中加入无血清培养基，活化；将所述细胞悬液加入活化后的预包被板板孔中。S600：进行染色，检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述得到纯化后的mRNA包括以下步骤：S101：线性化模板制备；S102：体外转录；S103：加帽；S104：线性化模板去除；S105：mRNA纯化。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S300的iDC转染中，mRNA与iDC细胞的比例为：0.5μg～5μg：5
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104。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S300的iDC转染中，mRNA与iDC细...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵钊，顾亦斐，涂苗苗，万季，潘有东，王弈，
申请(专利权)人：深圳新合睿恩生物医疗科技有限公司北京新合睿恩生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：