一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法，即向同一管中添加第一轮Siglec14/5融合突变基因的PCR扩增引物、第二轮靶向融合突变基因的qPCR检测引物和探针、以及靶向野生型正常Siglec14与Siglec5基因之间非编码区序列的qPCR检测引物和探针，通过调整变性

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法


[0001]本专利技术涉及生物化学
，具体涉及一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法。

技术介绍

[0002]B族链球菌(GBS)属于育龄女性常见的条件致病菌，在非孕妇的携带率约为35％，孕妇的携带率约为20～26％。孕妇有感染GBS可能会造成流产，早产、胎儿感染和胎儿损伤等严重后果。GBS致病性与宿主天然免疫系统密切相关，可以通过其表面的蛋白(cba基因编码的表面蛋白βProtein)与中性粒细胞表面一对功能相反的唾液酸黏附蛋白受体(Siglec
‑
5和Siglec
‑
14) 相互作用，激活或者抑制宿主免疫反应。
[0003]Siglec
‑
5和Siglec
‑
14在同一条染色体上，两个基因前后顺序排列，它们的5
’
端编码胞外序列的基因完全一致，而3
’
端编码胞内尾部序列差异较大，因此他们行使的功能大相径庭，Siglec
‑
5主要起到免疫抑制功能，而Siglec
‑
14 主要起到免疫激活功能，二者的启动子序列也存在较大差异，在基因复制的过程中，由于Siglec
‑
5和Siglec
‑
14存在较长的同源序列，容易发生同源重组，导致Siglec
‑
5的尾部重组至它们的一致性序列之后，使Siglec
>‑
14发生缺失突变，Siglec
‑
5利用Siglec
‑
14的启动子进行表达，仅产生Siglec
‑
5的表型(图 1)。
[0004]当女性的天然免疫系统的中性粒细胞表面行使免疫应答的激活受体 Siglec
‑
14在同源重组过程中与相似抑制受体Siglec
‑
5的发生融合突变，使得中性粒细胞仅存在Siglec
‑
5基因，GBS与Siglec
‑
5相结合，抑制了中性粒细胞对GBS的吞噬活性，造成了GBS的免疫逃逸，使其在宿主体内引起严重侵入感染或者传递至新生儿中，引起更严重的后果。
[0005]野生型Siglec
‑
5和Siglec
‑
14在同一条染色体上，两个基因前后顺序排列，它们之间的基因组非编码区序列长度大于15000bp，此片段在Siglec5和 Siglec14发生融合后被删除，形成Siglec
‑
14缺失突变型。由于Siglec
‑
14和 Siglec
‑
5野生型与Siglec
‑
14缺失突变型存在大量的一致性序列，其融合区域的长度大于1299bp，一致性大于99％，对于其检测存在较大的阻碍，利用普通的qPCR方法无法正常检测，目前的检测方法多数是通过普通PCR扩增，针对启动子和尾部序列的差异，分别设计引物进行扩增，将PCR产物进行电泳检测，通过序列长度和条带数量区分野生型，突变型和杂合型基因。但是PCR实验操作复杂，需要电泳检测及利用肉眼对条带进行判断，不仅耗时耗力，还很容易发生污染，非常不利于大范围推广，目前尚未出现该类体外诊断检测。由于Siglec
‑
5和Siglec
‑
14胞外受体部分存在部分差异，可以利用特异性抗体进行识别，但是抗体孵育时间长，干扰大，容易引起非特异性结合，并且需要分离完整细胞进行检测，操作难度大，不利于医疗诊断及大规模推广。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速检测与GBS相关的易感基因 Siglec14/
5及其融合突变的方法，检测快速、灵敏，成本低，便于推广。
[0007]基于上述问题，本专利技术提出的技术方案是提供一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法。
[0008]向同一管中添加三组引物及探针，连续进行PCR和qPCR两轮反应，所述引物包括第一轮Siglec14/5融合突变基因PCR扩增引物、第二轮靶向融合突变基因的qPCR检测引物和探针、以及靶向野生型正常Siglec14与Siglec5 基因之间非编码区序列的qPCR检测引物和探针。
[0009]其中，第一轮PCT引物Tm值高于第二轮qPCR引物Tm值，两轮反应均分别经过高温变性和退火延伸的过程，且第一轮PCR的退火温度大于第二轮退火温度。
[0010]在第二轮qPCR中利用荧光信号的不同一次性对Siglec基因的野生型、缺失突变型、杂合型进行有效区分。
[0011]其中，Siglec融合基因检测所用的引物和探针可选用表1或表2中所示的引物与探针，各引物与探针的具体序列如表1或表2所示：
[0012]表1 Siglec融合基因检测所用的引物和探针
[0013][0014][0015]表2 Siglec融合基因检测所用的另一组引物和探针
[0016][0017]其中，探针可以是普通Taqman探针或相同序列的MGB探针，探针可以是FAM、VIC、CY5、ROX、SYTO
‑
9通道中任意两种不同的标记。
[0018]具体反应过程如图2所示，第一轮PCR扩增的上游引物靶向Siglec14 基因启动子区域，下游引物靶向Siglec5基因的下游编码区，只有发生融合的基因才可被正常扩增，扩增长度为2672bp，而未发生融合的基因两个引物之间的长度为16933bp，在我们设定的延伸时间内无法正常扩增。其PCR下游引物由三部分组成。R部分为Siglec
‑
5基因的特异引物，A部分为第二轮 qPCR的探针靶向区域，该区域是人为添加且不与Siglec同源的DNA序列； O部分为第二轮qPCR检测的下游引物互补序列，同样为人为添加的非Siglec 同源DNA序列，在野生型和Siglec
‑
14缺失突变型中均存在引物R部分结合序列，但是由于未融合的基因长度远远大于融合后的基因长度，在优化的退火和延伸条件中仅可以扩增出Siglec
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14缺失突变型片段，长度为2672bp。新生成的PCR产物掺入了下游引物中人为添加的序列，由于第一轮PCR设计的引物Tm值远远高于第二轮qPCR的引物Tm值，保证在第一轮扩增过程中，第二轮qPCR检测的引物探针无法进行扩增。第二轮qPCR中的下游引物是在最初体系配制时同时加入，但是仅有当第一轮PCR实际进行后，退火温度降低后，才会被第二轮的qPCR检测到，在第二轮qPCR时，根据所采集荧光信号，判定待测样本中Siglec的基因型。
[0019]第二轮qPCR扩增可以对野生型Siglec
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14和Siglec
‑
5之间的序列进行扩增，如果有正常扩增的荧光信号，则判断为存在野生型基因；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法，其特征在于：向同一管中添加三组引物及探针，连续进行PCR和qPCR两轮反应，其中，所述引物包括第一轮Siglec14/5融合突变基因的PCR扩增引物、第二轮靶向融合突变基因的qPCR检测引物和探针以及靶向野生型正常Siglec14与Siglec5基因之间非编码区序列的qPCR检测引物和探针；其中，第一轮PCR引物Tm值高于第二轮qPCR引物Tm值，两轮PCR反应均分别经过高温变性和退火延伸的过程，且第一轮PCR的退火温度大于第二轮qPCR退火温度；在第二轮qPCR中利用荧光信号的不同一次性对Siglec基因的野生型、突变型、杂合型进行有效区分。2.根据权利要求1所述的快速检测与GBS相关的易感基因Siglec14/5及其融合突变的方法，其特征在于：Siglec
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GAP
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F
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1、Siglec
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GAP
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R
‑
1、Siglec
‑
GAP
‑
F
‑
2或Siglec
‑
GAP
‑
R
‑
2为正常Siglec基因之间非编码区序列的检测引物；Siglec
‑
GAP
‑
P
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1或Siglec
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GAP
‑
P
‑
2为正常Siglec基因之间非编码区序列的检测探针，仅在第二轮qPCR检测时进行反应；Siglec
‑
L
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F
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1或Siglec
‑
L
‑
F
‑
2靶向Siglec14基因启动子区域，为第一轮PCR上游扩增引物；Siglec
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L
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R
‑
1或Siglec
‑
L
‑
R
‑
2靶向Siglec5基因的下游编码区域，为第一轮PCR下游扩增引物；Siglec
‑
S
‑
F
‑
1或Siglec
‑
S
‑
F
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹洋，汪大为，曾桢，张蕾，鹿阳，冯慧军，李淑华，廖秦平，
申请(专利权)人：北京清华长庚医院，
类型：发明
国别省市：