一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽，所述抗真菌肽是由副干酪乳杆菌ALAC

【技术实现步骤摘要】
一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
特别涉及一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽，还涉及所述抗真菌肽的制备方法，及其在抑真菌中的应用。

技术介绍

[0002]真菌(霉菌和酵母菌)在食品工业中发挥着重要作用。它们参与发酵产品的制造和奶酪的成熟。然而，它们也会引起食品腐败变质。为了防止真菌生长，采用物理处理和添加化学防腐剂是最常用的技术手段，目前已经发现几种天然抗菌肽是安全有效的，可以作为传统化学防腐剂的新替代品。因此利用微生物及其代谢物来防止食品变质和延长食品的保质期引起了人们的广泛关注。
[0003]抗菌肽是生物体合成分泌对腐败菌或病原菌具有抑制活性的多肽，因其生物安全性及抑菌活性在食品加工保藏、饲料生产、及医药领域已有较成功应用。目前，国内外对抗真菌肽的研究多集中于植物、动物和微生物的分离源，其中微生物源抗真菌肽大多分离自霉菌和酵母菌，对于分离自乳酸菌的抗真菌肽报道不多。并且商业生产的抗真菌剂全部是非乳酸菌来源的产品或化学合成小分子化合物，这大大影响了其在食品和饲料等领域的应用，绝大多数只能作为药品用于临床治疗，而不能用于食品和饲料的防腐防霉。
[0004]目前还缺乏可以具有实际广泛应用的提取乳杆菌源抗真菌肽的方法，以及获得这些乳杆菌源抗真菌肽的氨基酸序列和抑菌性能，因此，本专利技术的专利技术人进行了大量实验研究，终于作出了本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术缺陷，提供一种分离自乳酸菌的抗真菌肽。r/>[0006]本专利技术的思路是基于本团队前期从内蒙古传统发酵食品中大量分离获得的副干酪乳杆菌ALAC
‑
4，通过研究分析其分泌的多肽对常见食品致腐霉菌和酵母所具备的活性，确认能够实现一种新的具有抗真菌活性的抗菌肽。
[0007]为此，本专利技术提供一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽，其特征在于所述抗真菌肽是由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC
‑
4产生的，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC
‑
4已于2018年4月2 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为CGMCCNo.15548。
[0008]在本专利技术中，所述抗真菌肽含有肽段APTs和APTft，所述肽段APTs 的氨基酸序列如SEQ No.1所示，所述肽段APTft的氨基酸序列如SEQNo.2所示。
[0009]本专利技术还提供上述分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)硫酸铵沉淀法粗提取
[0011]将副干酪乳杆菌ALAC
‑
4接种于MRS培养基进行培养，所得发酵液经离心后得到无
细胞发酵上清液，将上清液抽滤除杂后进行真空浓缩，然后向浓缩液加入60％饱和硫酸铵溶液，经静置、离心后，弃去上清，所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后得到粗提液；
[0012](2)透析除盐
[0013]将所得粗提液用截留分子质量为5000D的透析袋进行透析，得到经过透析的粗提液；
[0014](3)超滤分离
[0015]将经过透析的粗提液依次通过截留分子量分别为5kDa、3kDa和1kDa 的超滤膜，收集膜上和膜下的过滤液，经双层平板牛津杯法测定抑菌活性后，将具有抑菌活性的分子量大于3kDa馏分冷冻干燥后备用；
[0016](4)层析分离
[0017]葡聚糖凝胶SephadexG
‑
50填料经预处理后装入1.0mm
×
16cm的层析柱，平衡后，将步骤(3)得到的馏分复溶后从顶端注入凝胶色谱柱上样，上样量为1.5mL，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱，流速为2.5ml/min，每5ml作为一个馏分依次共收集30个馏分，经双层平板牛津杯法测定抑菌活性后，将抑菌活性最强的馏分冻干备用；
[0018](5)质谱分离鉴定
[0019]对步骤(4)得到的馏分进行第一次高分辨液质联用质谱分析和C18 液相色谱制备，对活性馏分作进一步分离和抗菌活性追踪，对具有活性的肽段进行第二次质谱分析鉴定，确认获得两个活性肽段APTs和APTft。
[0020]在本专利技术中，步骤(4)中，抑菌活性最强的馏分是第12份馏分。
[0021]本专利技术还提供上述分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽在抑菌中的应用。
[0022]特别地，所述抗真菌肽用于抑制白假丝酵母菌、黑曲霉和/或青霉。
[0023]本专利技术制备得到的高纯度乳杆菌源抗真菌肽具有较小分子量和特定氨基酸序列，能够有效抑制真菌生长繁殖，因此在食品和饲料领域中具有很广阔的应用前景。
附图说明
[0024]图1是超滤后不同组分的抑菌试验结果。
[0025]阴性对照为无菌去离子水。高为＞5kDa的组分，低为3kDa＜M＜ 5kDa的组分。
[0026]图2是Tricine
‑
SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果。
[0027]各泳道对应样品为1：蛋白标准Marker；2：小分子相原样250mg/mL； 3：小分子相原样150mg/mL；4：小分子水相60mg/mL；5：小分子60％洗脱相50mg/mL；6：大分子相原样160mg/mL；7：大分子相原样100mg/mL； 8：大分子水相60mg/mL；9：大分子60％洗脱相50mg/mL；10：大分子90％洗脱相40mg/mL。
[0028]图3是SephadexG
‑
50凝胶过滤色谱图。
[0029]图4是凝胶过滤层析收集不同组分的抑菌试验结果。
[0030]图5是抗菌肽APTs的二级质谱图。
[0031]图6是抗菌肽APTft的二级质谱图。
[0032]图7是LC
‑
MS/MS鉴定肽段的抑菌活性验证结果。
[0033]指示菌从左到右分别为：白假丝酵母菌、黑曲霉、青霉、毛霉；2号为APTs，3号为APTft，1和4为阴性对照：无菌去离子水。
具体实施方式
[0034]以下实施例用于非限制性地解释本专利技术的技术方案。
[0035]在本专利技术中，如无特殊说明，用于解释浓度的“％”均为质量百分比。
[0036]本专利技术涉及以下培养基：
[0037]MRS培养基：细菌学蛋白胨1％，酵母提取粉0.5％，葡萄糖2％，无水乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾2％，柠檬酸氢二铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，Tween
‑
80 1mL，牛肉浸膏1％，调pH至6.5，121℃，20 min灭菌。
[0038]YEPD培养基：酵母提取粉1％，大豆蛋白胨2％，葡萄糖2％，调pH 至6.0，115℃，20min灭菌。
[0039]PDA培养基：马铃薯浸出粉0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽，其特征在于所述抗真菌肽是由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC
‑
4产生的，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ALAC
‑
4已于2018年4月2日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.15548。2.根据权利要求1所述的分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽，其特征在于所述抗真菌肽含有肽段APTs和APTft，所述肽段APTs的氨基酸序列如SEQ No.1所示，所述肽段APTft的氨基酸序列如SEQ No.2所示。3.权利要求1所述的分离自副干酪乳杆菌的抗真菌肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)硫酸铵沉淀法粗提取将副干酪乳杆菌ALAC
‑
4接种于MRS培养基进行培养，所得发酵液经离心后得到无细胞发酵上清液，将上清液抽滤除杂后进行真空浓缩，然后向浓缩液加入60％饱和硫酸铵溶液，经静置、离心后，弃去上清，所得沉淀用磷酸盐缓冲液溶解后得到粗提液；(2)透析除盐将所得粗提液用截留分子质量为5000D的透析袋进行透析，得到经过透析的粗提液；(3)超滤分离将经过透析的粗提液依次通过截留分子...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈忠军，满都拉，孙子羽，王帅，刘瑾，董晶，杜旭婷，岳子尧，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：