一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用。采用如SEQ ID NO.1所示的基因序列以及如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，解决了目前尚未有虾虹彩病毒DIV1的中和抗体的问题。通过本发明专利技术制备得到的针对虾虹彩病毒DIV1的抗体能够特异性地识别DIVI病毒，并具有良好的病毒中和活性，能够有效降低DIV1病毒感染造成的对虾死亡，显著提高对虾抵抗DIV1病毒感染的能力，有效阻止病毒的感染与传播。与传播。与传播。

【技术实现步骤摘要】
一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子免疫学和病原生物学交叉
，具体涉及一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]虾虹彩病毒病是一种急性传染性疾病，其病原为虹彩病毒科的一个新属，即十足目虹彩病毒属的十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)。DIV1是一种具有线性双链DNA的胞浆型病毒，病毒在斜射光的照射下会出现虹彩现象，因而被称为虹彩病毒。对虾感染DIV1后表现为肝胰腺颜色变浅、空肠空胃和甲壳变软，可在短期内引起大面积死亡。目前，虾养殖业对于虾虹彩病毒主要以预防为主，例如采用严格消毒池塘、及时集污排污等措施，尚无针对虾虹彩病毒病有效的防治措施。
[0003]单克隆抗体制剂具有良好的靶向性，现有的利用单克隆抗体进行对虾病害的预防和治疗，主要通过研制靶向病原的中和抗体，即由适应性免疫应答细胞分泌的能与相应病原特异性结合的免疫球蛋白，利用抗体中和病原体入侵细胞，或中和病原体产生的毒素，进而达到防止病毒侵染的目的。近年来的研究证实，单克隆抗体制剂在多种对虾养殖重大病害的预防和治疗方面具有不错的效果，例如，公开号为CN 114702574 A的中国专利申请公开了一种抗WSSV病毒囊膜蛋白VP28单链抗体制备方法及其应用，该抗体能够特异性识别WSSV病毒粒子，并且可以有效中和病毒，大幅减低病毒感染造成的对虾死亡。再如，公开号为CN 110776565 A的中国专利申请公开了一种抗副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的卵黄抗体。该抗体能够高效结合病原弧菌，抑制副溶血弧菌生长，并且对副溶血性弧菌感染引起的对虾早死综合征具有优异的预防和治疗效果。目前，现有技术中尚无靶向DIV1病毒特异的中和抗体研制的技术方案。基于此，提出此专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。
[0005]本专利技术提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用，技术方案如下：
[0006]一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0009]S1：以条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用虾虹彩病毒DIV1为抗原进行免疫，提取免疫鲨鱼外周血淋巴细胞的总RNA，逆转录为cDNA，并以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨的鲨源单域抗体vNAR片段；
[0010]S2：将扩增后的鲨源单域抗体vNAR基因片段与噬菌粒载体构建重组噬菌粒载体，将重组噬菌粒载体转化感受态细胞中，扩大培养后得到DIV1噬菌体抗体库；
[0011]S3：对DIV1噬菌体抗体库筛选阳性克隆D70，并对阳性克隆D70的基因序列进行测序分析；
[0012]S4：扩增D70所含vNAR基因片段，将扩增后的产物克隆入表达载体得到重组表达载体，将重组表达载体转化感受态细胞中，筛选出阳性菌株后，扩大培养后加入诱导剂诱导表达，收集纯化抗体蛋白，即针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体。
[0013]本专利技术实施例的有益效果如下：
[0014]1.本专利技术提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体采用如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，解决了目前尚未有靶向虾虹彩病毒DIV1的中和抗体。本专利技术制备得到的针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体能够特异性地识别DIVI病毒，并具有良好的病毒中和活性，能够有效降低DIV1病毒感染造成的对虾死亡，显著提高对虾抵抗DIV1病毒感染的能力，有效阻止病毒的感染与传播。
[0015]2.本专利技术提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体在制备防治虾虹彩病毒DIV1的饲料中的应用，实验表明，将针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体作为饲料添加剂使用，通过口饲含有中和抗体的虾饲料，能降低对虾感染虹彩病毒的死亡率。
附图说明
[0016]图1为根据本专利技术所制备的DIV1的中和抗体的SDS
‑
PAGE凝胶电泳结果示意图；
[0017]图2为ELISA检测所制备中和抗体对天然DIV1病毒的识别实验结果示意图；
[0018]图3为利用Western Blot检测所制备中和抗体对DIV1病毒的特异性识别结果示意图；
[0019]图4为所制备中和抗体的免疫原性检测结果；
[0020]图5为所制备中和抗体内中和DIV1病毒效果的检测结果；
[0021]图6为对虾经口感染DIV1病毒实验死亡率统计结果；
[0022]图7为口饲DIV1中和抗体对对虾虹彩病毒病的治疗效果检测结果。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例，并参照附图，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述。
[0024]实施例1：
[0025]单域抗体(single
‑
domain antibody，SdAb)只包含单一的抗体可变区(VH/VL)。同常规的抗体一样，它也能够选择性地结合特定抗原。单域抗体的分子量仅为12
‑
15kDa，远小于由两条重链和两条轻链组成的普通抗体(150
‑
160kDa)。
[0026]鲨源单域抗体即鲨源新抗原受体可变区(Variable domain of immunoglobulin new antigen receptor，vNAR)，是基于鲨总目鱼类天然存在的新抗原受体(Immunoglobulin new antigen receptor，IgNAR)并通过基因工程技术获得的抗原结合域，其分子量仅为12kDa，是目前已知脊椎动物中尺寸最小的抗原结合域。鲨源单域抗体具有分子量小、稳定性高、易于基因工程改造和便于规模化生产等独特优势，已成为开发分子探针、疾病诊断试剂盒以及疾病治疗药物的良好原料。
[0027]一种针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0028]1、噬菌体抗体文库的构建：
[0029](1)以纯化的虾虹彩病毒DIVI病毒对条纹斑竹鲨进行免疫，具体方法如下：以5x106copies/kg的DIV1病毒剂量，对条纹斑竹鲨进行皮下多点注射，视作1次免疫，共进行免疫6次，相邻两次免疫的时间间隔为14天。
[0030](2)完成步骤(1)中的免疫后，采集免疫鲨鱼外周血单核细胞，先采用QIAGEN公司的RNA抽提试剂盒提取该免疫鲨鱼外周血单核细胞的总RNA，采用TAKARA公司的PrimeScript
TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit将该免疫鲨鱼外周血单核细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体，其特征在于，所述针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体，其特征在于，所述针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1
‑
2任一所述的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：以条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用虹彩病毒DIV1为抗原进行免疫后，提取免疫鲨鱼外周血淋巴细胞总RNA，逆转录为cDNA，并以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨的鲨源单域抗体vNAR片...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈锦霖，程云英，叶雯，陈建明，郑秦，姜身飞，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：