湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用。一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基，包括：Advanced DMEM/F

【技术实现步骤摘要】
湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物组织培养
，涉及一种类器官培养方法，具体涉及一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用。

技术介绍

[0002]反刍动物的复胃包括瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃，其中成年反刍动物的瘤胃可占复胃总容积80％，是反刍动物主要产能场所，在反刍动物适应复杂生态环境的过程中发挥了重要作用。瘤胃上皮属于复层鳞状上皮，具有屏障、免疫、能量代谢等功能，从下往上分别为基底层、棘层、颗粒层与角质层。角质形成细胞从基底层开始向上迁移，不断分裂分化，直到形成死亡的角质层。
[0003]在反刍动物养殖过程中许多与营养代谢相关的问题与瘤胃相关，直接利用反刍动物进行试验，花费较为高昂、影响动物福利且试验周期较长，因此需要探索一种可降低试验成本减少活体动物消耗的方法。类器官是一种在体外由成体干细胞或多能干细胞诱导形成，具有与体内组织相似结构与功能的复杂3D结构，在发育生物学、疾病建模、药物开发、再生医学等领域有非常重要的应用前景。从2009年科学家成功建立小鼠小肠类器官以来，包括皮质、腺垂体、甲状腺、视杯、食管、胃、结肠、前列腺、肝脏、皮肤等多种组织在内的类器官相继被成功构建。2017年类器官被Nature Methods评为生命科学领域年度技术，国家重点研发计划也将类器官收录在内，说明类器官在探索生物学方面具有巨大潜力。目前，关于瘤胃上皮的体外模型，国内外已有文献报道从奶牛、山羊和绵羊的瘤胃上皮组织分离瘤胃上皮细胞并建立长期培养体系，而相比于2D培养更能反映复杂组织结构的3D类器官培养尚未报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种湖羊瘤胃上皮类器官的体外构建方法，该方法得到的湖羊瘤胃上皮类器官，保留了类似瘤胃上皮组织的结构，可用于体外试验，从而降低试验成本。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基，该培养基包括：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、N
‑
2添加剂、B
‑
27添加剂、GlutaMax、青霉素、链霉素、HEPES、烟酰胺、N
‑
乙酰
‑
L
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半胱氨酸、表皮生长因子(EGF)、Wnt3a蛋白、R
‑
spondin1蛋白、Noggin蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632。该培养基中由于添加了CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632这四种组分，得以成功的培养出湖羊瘤胃上皮类器官。
[0007]类器官可以从成体干细胞或多能干细胞诱导，对于从成体干细胞诱导的类器官而言，类器官培养的关键在于成体干细胞的分离与类器官培养基的构建。瘤胃基底层细胞通
过分裂分化使瘤胃上皮细胞不断更新，具有干细胞特征，因此分离瘤胃上皮基底层细胞并通过类器官培养基诱导形成类器官具有可行性。类器官培养基中各种添加剂是诱导成体干细胞分裂分化形成类器官的关键因素，专利技术人前期设计了数十种培养基均不能实现湖羊瘤胃上皮类器官的培养，最终发现同时添加CHIR99021、A8301、SB202190和Y27632四种小分子抑制剂的类器官培养基可以成功诱导湖羊瘤胃上皮类器官的建立。
[0008]作为优选，该培养基含有如下组分：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、1
×
N
‑
2添加剂、1
×
B
‑
27添加剂、1
×
GlutaMax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10～25mM HEPES、10～12mM烟酰胺、1～1.5mM N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸、50～100ng/mL表皮生长因子(EGF)、100～200ng/mL Wnt3a蛋白、100～200ng/mL R
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spondin1蛋白、100～200ng/mL Noggin蛋白、100～200ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、100～200ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)、3～6μΜCHIR99021、5～10μΜA8301、10～20μΜSB202190、10～20μΜY27632。
[0009]作为优选，该培养基含有如下组分：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、1
×
N
‑
2添加剂、1
×
B
‑
27添加剂、1
×
GlutaMax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mM HEPES、10mM烟酰胺、1mM N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸、50ng/mL表皮生长因子(EGF)、100ng/mL Wnt3a蛋白、100ng/mL R
‑
spondin1蛋白、100ng/mL Noggin蛋白、100ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、100ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)、3μΜCHIR99021、5μΜA8301、10μΜSB202190、10μΜY27632。
[0010]一种湖羊瘤胃上皮细胞培养基，该培养基包括：DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰岛素、表皮生长因子(EGF)和Y
‑
27632。Y
‑
27632是保持干细胞活性，抑制干细胞凋亡的小分子抑制剂，本专利技术在上皮细胞培养基中添加Y
‑
27632的目的是在2D培养过程中防止具有干性的瘤胃上皮细胞死亡。
[0011]作为优选，所述每1L上皮细胞培养基含有：900mL DMEM、100mL胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5μg/mL胰岛素、10ng/mL表皮生长因子(EGF)、10μM Y
‑
27632。
[0012]一种湖羊瘤胃上皮类器官的体外构建方法，该方法包括以下步骤：
[0013](1)采样：取湖羊瘤胃，用含4抗的PBS冲洗并剥离肌肉层，在含4抗的DMEM中储存；所述4抗是青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B四种抗生素；
[0014](2)瘤胃上皮细胞分离：将上皮组织分成小块，用含4抗的PBS多次清洗，清洗后的上皮组织小块加入胰蛋白酶
‑
EDTA消化液在37℃水浴振荡消化，等到圆形的上皮细胞被消化下来后终止消化并收集细胞；
[0015](3)瘤胃上皮细胞培养：分离的细胞悬浮在上皮细胞培养基中后在CO2恒温培养箱中培养，瘤胃上皮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基，其特征在于该培养基包括：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、N
‑
2添加剂、B
‑
27添加剂、GlutaMax、青霉素、链霉素、HEPES、烟酰胺、N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸、表皮生长因子(EGF)、Wnt3a蛋白、R
‑
spondin1蛋白、Noggin蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632。2.根据权利要求1所述的湖羊瘤胃上皮类器官培养基，其特征在于该培养基含有如下组分：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、1
×
N
‑
2添加剂、1
×
B
‑
27添加剂、1
×
GlutaMax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10～25mM HEPES、10～12mM烟酰胺、1～1.5mM N
‑
乙酰
‑
L
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半胱氨酸、50～100ng/mL表皮生长因子(EGF)、100～200ng/mL Wnt3a蛋白、100～200ng/mL R
‑
spondin1蛋白、100～200ng/mL Noggin蛋白、100～200ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)、100～200ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)、3～6μΜCHIR99021、5～10μΜA8301、10～20μΜSB202190、10～20μΜY27632。3.根据权利要求1所述的湖羊瘤胃上皮类器官培养基，其特征在于该培养基含有如下组分：Advanced DMEM/F
‑
12基础培养基、1
×
N
‑
2添加剂、1
×
B
‑
27添加剂、1
×
GlutaMax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mM HEPES、10mM烟酰胺、1mM N
‑
乙酰
‑
L
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【专利技术属性】
技术研发人员：王佳堃，徐泽邦，杨斌，黄开朗，曾洪波，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：