【技术实现步骤摘要】
一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株的试剂盒与检测方法
[0001]本专利技术涉及一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株的试剂盒与检测方法，属于生物检测
技术介绍
[0002]布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。布鲁氏杆菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁氏杆菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。
[0003]布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。布鲁氏杆菌广泛分布于世界各地，调查全世界有170个国家和地区有布鲁氏菌病报道发生人布鲁氏菌病亦呈上升趋势，人布鲁氏菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁氏菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁氏菌病。
[0004]一方面，传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；RT
‑
PCR需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带和需要专业人员操作等。另一方面，现有的布鲁氏杆菌的试剂盒虽然能够实现布鲁氏杆菌的检测，但是无法对布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株进行区分和鉴别。因此，亟需研发一种能够检测布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株的试剂盒。>
技术实现思路
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和疫苗株的试剂盒与检测方法。
[0006]本专利技术技术方案如下：
[0007]一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的crRNA，所述crRNA为crRNA(WT)和crRNA(Vac)的组合；
[0008]所述crRNA(WT)的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的crDNA，所述crDNA为crDNA(WT)和crDNA(Vac)的组合；
[0010]所述crDNA(WT)的序列如SEQ ID NO.3所示；所述crDNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]一种检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的DNA，所述DNA为DNA(WT)和DNA(Vac)的组合；
[0012]所述DNA(WT)的序列如SEQ ID NO.5所示；所述DNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.6所
示。
[0013]所述crRNA(WT)和crRNA(Vac)可以经人工合成得到，或以crDNA(WT)和crDNA(Vac)为模板转录得到，所述DNA(WT)是crRNA(WT)的靶向序列，所述DNA(Vac)是crRNA(Vac)的靶向序列，用于检测和区分布鲁氏杆菌野生菌株和布鲁氏杆菌S2疫苗株。
[0014]一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的试剂盒，其特征在于，包含上述crRNA或crDNA。
[0015]根据本专利技术优选的，所述试剂盒为胶体金试纸条试剂盒。
[0016]进一步优选的，所述胶体金试纸条试剂盒包括Cas13a蛋白和胶体金试纸条；所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线；所述第一检测线上固定有TAMRA配体，所述第二检测线上固定有Biotin配体。
[0017]一种利用上述试剂盒以非诊断目的检测鉴别布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的方法，包括步骤如下：
[0018](1)提取待测样本的基因组；
[0019](2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；
[0020](3)取RPA扩增产物分别建立第一检测体系和第二检测体系，在37℃下，孵育10～60min；
[0021](4)将第一检测体系和第二检测体系按照等体积混合均匀，再加入无酶水得到反应液，然后将反应液滴至试纸条，5～10分钟后，第一检测线无条带、第二检测线有条带时，表明待测样本是野生菌株；第一检测线有条带、第二检测线无条带时，表明待测样本是S2疫苗株；当第一检测线和第二检测线均有条带时，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。
[0022]根据本专利技术优选的，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。
[0023]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增的引物序列为：
[0024]正向引物：
[0025]5'
‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGTCAGCCCGCCATCCACACTCGCCA G
‑
3'；
[0026]反向引物：5'
‑
TTGCGGGTGGTTATTCCTTTCACCCTTTAC
‑
3'。
[0027]根据本专利技术优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增体系为：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，总体积10μL。
[0028]扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。
[0029]其中，RPA基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmp
R
Basic试剂盒，RPA基础反应球为球状固体，内含重组酶、聚合酶等成分。
[0030]根据本专利技术优选的，步骤(3)中，所述第一检测体系为：Tris
‑
HCl(400mM)、MgCl2(120mM)、T7 Polymerase 0.5μL、rNTP 0.8μL、reporter1(1μM)、crRNA(WT)1μL、RNase Inhibitor 1μL、Cas13a蛋白1μL，RPA扩增产物1μL，总体积20μL；所述reporter1为5
’‑
DIG
‑
UUUUUUUUUUUUUU
‑
TAMRA
‑3’
；
[0031]所述第二检测体系为：Tris
‑
HCl(400mM)、MgCl2(120mM)、reporter2(1μM)、crRNA
(Vac)1μL、RNase Inhibitor 1μL、Cas13a蛋白2μL、T7 Polymerase 0.5μL、rNTP 0.8μL，RPA扩增产物1μL，总体积20μL；所述reporter2为5
’‑
FAM
‑
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的crRNA，其特征在于，所述crRNA为crRNA(WT)和crRNA(Vac)的组合；所述crRNA(WT)的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的crDNA，其特征在于，所述crDNA为crDNA(WT)和crDNA(Vac)的组合；所述crDNA(WT)的序列如SEQ ID NO.3所示；所述crDNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的DNA，其特征在于，所述DNA为DNA(WT)和DNA(Vac)的组合；所述DNA(WT)的序列如SEQ ID NO.5所示；所述DNA(Vac)的序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的crRNA或权利要求2所述的crDNA。5.如权利要求4所述的用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为胶体金试纸条试剂盒；所述胶体金试纸条试剂盒包括Cas13a蛋白和胶体金试纸条。6.如权利要求5所述的用于检测布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线；所述第一检测线上固定有TAMRA配体，所述第二检测线上固定有Biotin配体。7.一种利用权利要求7所述的试剂盒以非诊断目的检测鉴别布鲁氏杆菌野生菌株和/或疫苗株的方法，包括步骤如下：(1)提取待测样本的基因组；(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；(3)取RPA扩增产物分别建立第一检测体系和第二检测体系，在37℃下，孵育10～60min；(4)将第一检测体系和第二检测体系按照等体积混合均匀，再加入无酶水得到反应液，然后将反应液滴至试纸条，5～10分钟后，第一检测线无条带、第二检测线有条带时，表明待测样本是野生菌株；第一检测线有条带、第二检测线无条带时，表明待测样本是S2疫苗株；当第一检测线和第二检测线均有条带时，表明待测样本不存在布鲁氏杆菌感染。8.如权利要求7所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：王国俊，李学洋，李怀珠，韩琪，张乾义，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
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