一种骨髓染色体标本制作方法技术

本发明专利技术涉及生物科学、遗传学技术领域，且公开了一种骨髓染色体标本制作方法，包括以下步骤：预处理，得到下肢长骨，获取蛙骨髓细胞；吸取中层的骨髓细胞悬液于10ml的玻璃离心管中；离心弃上清液，留沉淀的细胞；低渗；预固定；固定；滴片；进行染色，得到骨髓染色体标本。本发明专利技术提供的方法，实验总时长为2.5h,可以保证本实验内容可以在一次实验课(3h)中完成，实验的成功率高，达标率(A

【技术实现步骤摘要】
一种骨髓染色体标本制作方法


[0001]本专利技术涉及生物科学、遗传学
，具体涉及一种骨髓染色体标本制作方法。

技术介绍

[0002]染色体标本的制备是生命科学专业本科教学中必须掌握的一项基本技能，是细胞遗传学研究最基本的技术。优良的染色体制片是其他技术(如显带、原位杂交、细胞毒理检测等)的基础。但在历年的教学中发现不论是教科书[1、2]还是相关文献[3]对操作技术的描述都存在不完善的地方，例如实验步骤不够标准化和量化等，从而导致实验结果不稳定，失败率高。
[0003]适合做实验教学的骨髓染色体标本需满足以下条件：
[0004]实验材料容易获取；实验条件要标准化和量化；实验步骤简单并可复制；分裂相细胞要多；染色体分散并且没有重叠的细胞要多；染色体的形态要典型；完成实验的时间控制在3h内，即一次实验课的时间；90％以上同学在实验课上能达到实验要求。
[0005]现有的操作方法有如下：中国专利一种染色体只制片方法，公开号：CN201310226759.7、骨髓染色体提取试剂盒，公开号：CN103710435A、实验技术蟾蜍或黑斑蛙骨髓染色体标本的制备以及实验技术小鼠骨髓染色体标本的制备。
[0006]上述方案中小鼠骨髓染色体标本的制备，存在染色体的类型不够多，不适合教学；而蟾蜍不易获得，从而增加实验材料准备的难度。
[0007]CN201310226759.7、骨髓染色体提取试剂盒，公开号：CN103710435A、实验技术蟾蜍或黑斑蛙骨髓染色体标本的制备以及实验技术蟾蜍或黑斑蛙骨髓染色体标本的制备，取材的方法和时间、低渗的温度和时间、预固定、固定的时间和次数、是否吹打和吹打的力度、载玻片的倾斜度和滴片的高度等步骤的描述仅为一个范围，不够标准化和量化，实验过程中不可控因素较多，在教学中复制难度大，造成实验结果不稳定。
[0008]综上，现有技术中，蛙的骨髓细胞需要培养，耗时(3
‑
4h)，在教学中繁琐，为此我们提出了一种骨髓染色体标本制作方法。

技术实现思路

[0009](一)解决的技术问题
[0010]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种骨髓染色体标本制作方法，选择一个合适的实验材料，它既容易获取，同时该材料的染色体类型比较多，适合应用于实验教学。
[0011](二)技术方案
[0012]为实现上述所述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0013]一种骨髓染色体标本制作方法，包括以下步骤：
[0014]第一步：预处理，实验前4
‑
9h在黑斑蛙腹腔注射秋水仙素，注射比例为2μg/g体重；
[0015]第二步：在30min内完成对预处理后的黑斑蛙进行取材，得到下肢长骨；
[0016]第三步：在5min内完成剪碎下肢长骨获取蛙骨髓细胞；
[0017]第四步：在30min内完成低渗，将中的骨髓细胞悬液置于40
±
1℃的水浴锅中，水浴25min，水浴结束后立即尽可能多地吸取中层的骨髓细胞悬液于10ml的玻璃离心管中；
[0018]第五步：进行预固定，在离心管中，加固定液至8ml，吹打，离心弃上清液，留沉淀的细胞；
[0019]第六步：进行固定，在离心管中加入4ml固定液，大力吹打，再加入4ml固定液，吹匀，静置20min，离心，弃上清液，留细胞沉淀，然后重复本步骤一次；
[0020]第七步：在细胞悬液中加入固定液，用吸管轻轻吹匀，持洁净冰片置实验台上，保持载玻片与台面30
‑
45度倾斜，持长滴管，吸1
‑
2滴细胞悬液，滴管和载玻片间的距离保持在50cm左右，在载玻片上端滴下细胞悬液1
‑
2滴，细胞悬液顺势铺在载玻片上；
[0021]第八步；进行染色，得到骨髓染色体标本。
[0022]优选的，第二步中取材包括：处死蛙、剪断蛙、剥皮、去肌肉以及分关节，最后用洁净的干纱布清除下肢长骨上的肌肉和结缔组织，得到下肢长骨。
[0023]优选的，第三步的骨髓细胞获取具体内容如下：将下肢长骨置烧杯中，加入1ml0.075mol的KCL溶液，用剪刀将下肢长骨剪碎，此时骨髓细胞悬浮于溶液中，最后再加入7ml 0.075mol的KCL溶液。
[0024]优选的，第五步中吹打时间为5min，离心转速为1000r/min，离心时间为7min。
[0025]优选的，第六步中的吹打时间为10min，离心转速为1000r/min，离心时间为7min。
[0026]优选的，第七步中的洁净冰片为0℃载玻片。
[0027]优选的，第八步中的染色具体内容为：用10％吉姆萨染液扣染10
‑
20min，用0.1mol/lPBS稀释原液，磷酸缓冲液PH值6.8
‑
6.9，自来水冲洗，自然干燥。
[0028](三)有益效果
[0029]与现有技术相比，本专利技术提供的骨髓染色体标本制作方法，具备以下有益效果：
[0030]1、该骨髓染色体标本制作方法，采用的是黑斑蛙，价钱合适，黑斑蛙的染色体类型较多，有中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色体、端着丝粒染色体以及带随体的染色体等。染色体数量为26条，比较适中，因此，黑斑蛙适合在教学中做染色体标本的材料。
[0031]2、该骨髓染色体标本制作方法，采用简单的方法将黑斑蛙处死、剥皮、去肌肉，分离关节，最后得到4根干净游离的下肢长骨。此步骤的总时长设计为不超过30min。这样既可以保证学生能在此时间内完成取材的工作，又能最大限度地降低细胞离体后结构改变的程度。
[0032]3、该骨髓染色体标本制作方法，采用剪骨法获取骨髓细胞，剪骨时长为5min，采用此方法获取骨髓细胞，可以避免学生由于操作不熟练而造成骨髓细胞的丢失。黑斑蛙的下肢长骨比较细，较易操作。
[0033]4、该骨髓染色体标本制作方法，明确了低渗的时间为30min、温度为40
±
1℃，低渗的目的是降低细胞质的浓度，从而使染色体更好地分散。低渗时间和低渗时的温度是影响其效果的最重要因素。低渗时间不足和温度低，都达不到此效果，时间过长或温度过高则会导致细胞膜的破裂。经实验证明黑斑蛙骨髓细胞的低渗的时间为30min、温度为40
±
1℃时低渗效果最佳。
[0034]5、该骨髓染色体标本制作方法，采用大力吹打细胞悬液，处在分裂中期的染色，尽管细胞核膜已经消失，染色体分散在细胞质中，但由于染色体具有一定的柔软性，相互之间
会缠扰在一起，大力吹打10min有助于将这些染色体分散。
[0035]6、该骨髓染色体标本制作方法，固定次数为2次，而非3次既可以保证细胞的结构不发生改变，又缩短了实验的总时长。
[0036]7、该骨髓染色体标本制作方法，滴片高度保持在50cm左右，经过低渗的细胞，细胞质含水量较高。将细胞从较高处滴下，有助于细胞膜的破裂。染色体没有了细胞膜的阻碍，分散本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨髓染色体标本制作方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：预处理，实验前4
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9h在黑斑蛙腹腔注射秋水仙素，注射比例为2μg/g体重；第二步：在30min内完成对预处理后的黑斑蛙进行取材，得到下肢长骨；第三步：在5min内完成剪碎下肢长骨获取蛙骨髓细胞；第四步：在30min内完成低渗，将中的骨髓细胞悬液置于40
±
1℃的水浴锅中，水浴25min，水浴结束后立即尽可能多地吸取中层的骨髓细胞悬液于10ml的玻璃离心管中；第五步：进行预固定，在离心管中，加固定液至8ml，吹打，离心弃上清液，留沉淀的细胞；第六步：进行固定，在离心管中加入4ml固定液，大力吹打，再加入4ml固定液，吹匀，静置20min，离心，弃上清液，留细胞沉淀，然后重复本步骤一次；第七步：在细胞悬液中加入固定液，用吸管轻轻吹匀，持洁净冰片置实验台上，保持载玻片与台面30
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45度倾斜，持长滴管，吸1
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2滴细胞悬液，滴管和载玻片间的距离保持在50cm左右，在载玻片上端滴下细胞悬液1
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2滴，细胞悬液顺势铺在载玻片上；第八步；进行染色，得到骨髓染色体标本。2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪珍春，周伯春，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：