一种FAM50A蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种FAM50A蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用，所述多克隆抗体的制备方法具体为：构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将重组表达载体转化至大肠杆菌并诱导培养，收集FAM50A重组蛋白，再将FAM50A重组蛋白作为抗原免疫动物，取动物血清分离得到多克隆抗体。本发明专利技术制备的多克隆抗体能够特异性识别FAM50A蛋白，可用于FAM50A蛋白的检测及其蛋白功能鉴定、细胞定位等，对于研究FAM50A蛋白的生物学功能提供了重要的实验材料，对此蛋白的相关医学研究奠定了生物学基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
一种FAM50A蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于抗体制备
，具体涉及一种FAM50A蛋白多克隆抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]FAM50A(family with sequencesimilarity 50member A)，又称Xap5(X
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chromosome
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associated protein 5)，是一种蛋白质编码基因。该基因编码的蛋白质在长度和序列上在真核生物的不同物种中高度保守，它是一种含有核定位信号的基本蛋白，可能作为DNA结合蛋白或转录因子发挥作用。
[0003]研究表明FAM50A基因的缺失将导致一系列疾病的发生，例如畸形的面部特征、癫痫病的发作、智力发育障碍等，该基因在胚胎生长发育的过程中也起到了非常重要的作用。FAM50A在不同物种中的生化功能不尽相同，但是目前我们对其并不完全了解。
[0004]抗体是一种研究生化功能的基本实验材料，因此FAM50A抗体的制备对于深入研究FAM50A的生化功能以及对于人类相关疾病的防控等将具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在提供一种FAM50A蛋白多克隆抗体以及其制备方法，本专利技术以含有多个不同抗原决定簇的重组蛋白为免疫原，获得了针对不同抗原决定簇的抗体，且重组蛋白通过大肠杆菌表达系统得到，成本低且产量大。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术提供了一种FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
[0008]步骤1.构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体；
[0009]步骤2.将重组表达载体转化至大肠杆菌并诱导培养，再收集FAM50A重组蛋白，所述FAM50A重组蛋白含有SEQ ID NO.2所示序列；
[0010]步骤3.将FAM50A重组蛋白作为抗原免疫动物，取动物血清分离纯化后得到多克隆抗体。
[0011]进一步地，在上述技术方案中，步骤1具体为：以hTERT
‑
RPE1细胞系的总RNA为模板，反转录获得cDNA，再以cDNA为模板通过PCR扩增得到含SEQ ID NO.1所示序列的目的片段，将该片段连接至原核表达载体即得。
[0012]更进一步地，在本专利技术提供的一个具体实施案例中，PCR扩增所用引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，重组表达载体的基础载体为pGEX
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6P
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1，目的片段与载体pGEX
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6P
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1分别通过BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切后连接。
[0013]进一步地，在上述技术方案中，步骤2所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，步骤2中诱导培养的条件为：终浓度为0.3mM IPTG，37℃培养3h。
[0015]进一步地，在上述技术方案中，所述FAM50A重组蛋白的收集方法为：离心收集菌沉淀，用PBS多次离心洗涤后，依次加入蛋白酶抑制剂和溶菌酶反应；将菌液超声破碎，再加入终浓度为10％Triton
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X100和1mM DTT进行孵育，离心取上清液并用含有Glutathione
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agarose的过滤柱纯化蛋白。
[0016]进一步地，在上述技术方案中，步骤3中的免疫实验动物为兔。
[0017]进一步地，在上述技术方案中，步骤3中的免疫方式具体为：
[0018]初次免疫，用FAM50A重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化混合后于免疫实验动物；
[0019]待初次免疫3周后，用FAM50A重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化混合后第二次免疫实验动物，其中FAM50A重组蛋白用量为初次免疫的0.5倍；
[0020]待第二次免疫2周后，第三次免疫实验动物且所用试剂与第二次免疫一致；
[0021]待第三次免疫2周后，用FAM50A重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化混合后第四次免疫实验动物，其中FAM50A重组蛋白用量与初次免疫相同；
[0022]待第四次免疫完成1周后，即可取血分离抗体。
[0023]通过上述制备方法制得的FAM50A蛋白多克隆抗体能够特异性识别FAM50A蛋白，故其可应用于FAM50A蛋白的检测及功能鉴定等方面。
[0024]本专利技术的有益效果：本专利技术将构建成功的pGEX
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6P
‑1‑
FAM50A重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，通过原核表达系统得到重组蛋白；相较于天然抗原和多肽类抗原，本专利技术提供的重组蛋白不但含有多个不同的抗原决定簇，同时也容易短时间内大量生成。进一步利用该重组蛋白抗原生产的多克隆抗体，具有良好的特异性，可以用于检测具有高抗原同源性的已知或未知抗原亚型、低水平的同源抗原，并尽可能多的捕获抗原(例如免疫沉淀或染色质免疫沉淀)、变性蛋白质，具有可能的遗传多态性、糖基化或构象变化的靶标，跨多种检测类型检测天然蛋白。
附图说明
[0025]图1为实施例1中少量重组表达菌株诱导表达前后的SDS
‑
PAGE示图，其中，Marker为蛋白质标准分子量，泳道1为诱导表达前，泳道2为诱导表达后；
[0026]图2是实施例1中大量重组表达菌株诱导表达前后的SDS
‑
PAGE示图，其中，Marker为蛋白质标准分子量，泳道1为诱导前，泳道2为诱导后，泳道3为超声前，泳道4为超声后，泳道5为超声后上清，泳道6为超声后沉淀，泳道7、8均为重组蛋白；
[0027]图3是用hTERT
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RPE1
‑
pCMV
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C
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FAM50A
‑
GFP过表达细胞系蛋白样品进行Western blot检测示图，其中，Marker为蛋白质标准分子量，从左往右依次检测制备的FAM50A多克隆抗体、GPF抗体、内参抗体；
[0028]图4是免疫荧光检测FAM50A在hTERT
‑
RPE1细胞中的定位示图，其中，从左往右依次是制备的FAM50A多克隆抗体染色、DAPI染色、共定位。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术中的实施例和附图，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0030]下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]实施例1
[0032]本例制备了一种FAM50A多克隆抗体，具体过程包括如下步骤：
[0033](1)pGEX
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6P
‑1‑
FAM50A
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体；步骤2.将重组表达载体转化至大肠杆菌并诱导培养，再收集FAM50A重组蛋白，所述FAM50A重组蛋白含有SEQ ID NO.2所示序列；步骤3.将FAM50A重组蛋白作为抗原免疫动物，取动物血清分离纯化后得到多克隆抗体。2.根据权利要求1所述FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤1具体为：以hTERT
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RPE1细胞系的总RNA为模板，反转录获得cDNA，再以cDNA为模板通过PCR扩增得到含SEQ ID NO.1所示序列的目的片段，将该片段连接至原核表达载体即得。3.根据权利要求2所述FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增所用引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，所述重组表达载体的基础载体为pGEX
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6P
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1，所述目的片段与载体pGEX
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6P
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1分别通过BamHⅠ酶和EcoRⅠ酶进行双酶切后连接。4.根据权利要求1所述FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2所述大肠杆菌具体为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。5.根据权利要求1或4所述FAM50A蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤2中诱导培养的条件为...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢俊俏，王卫华，刘红妮，谢小燕，张熙琪，胡长峰，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：