具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过基因工程的手段将突变型的SIRPα表达于宿主细胞膜表面，可获得对肿瘤细胞表面CD47配体有主动靶向结合能力的细胞膜材料。利用该细胞膜材料对抗肿瘤纳米药物进行表面修饰，可实现高效递送药物至肿瘤部位；同时，通过竞争性结合肿瘤细胞表面的CD47配体，从而阻断巨噬细胞表面的SIRPα受体与CD47配体结合，进而恢复巨噬细胞的抗肿瘤活性。因此，这种新型细胞膜材料的构建为开发具有靶向结合肿瘤细胞的细胞膜材料提供创新方案。案。案。

【技术实现步骤摘要】
具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着纳米技术的发展，纳米粒作为药物递送载体已经在癌症的诊断和治疗领域得到了广泛的研究。然而，大多数纳米粒作为外来物质会被机体内的免疫系统识别和清除，以及生物相容性差，限制了这些纳米材料的实用性。因此，迫切需要寻求一种安全、有效和制备便捷的纳米递送系统逃逸免疫系统清除，以及增强的肿瘤靶向性。
[0003]基于仿生技术的生物膜介导的纳米药物递送系统利用细胞膜作为载体，在不考虑内核纳米材料特性的情况下，利用细胞膜表面蛋白质和多糖的功能促进核内纳米粒在体内的长循环和靶向递送，有望实现纳米技术在肿瘤靶向治疗上的新突破。自此，细胞膜仿生修饰纳米粒广泛地被探索和研究，如何开发创新型的细胞膜材料是目前研究面临的瓶颈问题。
[0004]鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料及其制备方法和应用，以克服现有细胞膜材料的缺乏，为纳米药物的递送提供载体。
[0006]本专利技术的技术构思：
[0007]细胞膜仿生纳米粒为药物高效递送至肿瘤部位提供解决方案，但如何开发具有靶向结合肿瘤细胞的细胞膜材料是目前面临的瓶颈问题。通过基因工程手段表达能靶向结合肿瘤细胞的特异蛋白于细胞膜表面的方式，为获得具有靶向结合肿瘤细胞表面配体的细胞膜材料提供解决途径。
[0008]专利技术人为了开发一种对肿瘤细胞有特异性识别能力的细胞膜材料，采用通过基因工程手段表达能靶向结合肿瘤细胞表面配体的特异蛋白于细胞膜表面的技术构想。因此，如何选取有效的能靶向结合肿瘤细胞表面配体的特异蛋白变的非常关键。调研文献发现，整合素相关蛋白(CD47)在各种白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、平滑肌肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、脑癌、肝癌、前列腺癌等几乎所有实体肿瘤中均高表达，CD47可与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(SIRPα)结合并发出“别吃我”信号，从而使癌细胞逃脱免疫系统的攻击，并参与肿瘤细胞增殖和迁移等多种生物功能。因此，SIRPα/CD47结合位点可作为靶向结合肿瘤细胞的靶点、以及肿瘤的治疗靶点。
[0009]但是，由于SIRPα作为一种跨膜的免疫球蛋白，天然的SIRPα与CD47的亲和力较弱。为了进一步提高目标产物细胞膜材料对肿瘤细胞的特异性识别能力，专利技术人通过设计不同的SIRPα突变体进行对比，获得比天然的SIRPα/CD47亲和力提高近5万倍的高亲和力的SIRP
α突变体(M
‑
SIRPα)，并以此为研究对象，通过一系列基因工程手段将这种高亲和力的M
‑
SIRPα表达于宿主细胞膜表面，再采用细胞膜提取技术，可获得增强的主动靶向结合肿瘤细胞表面CD47配体的新型细胞膜材料(CM
‑
M
‑
SIRPα)。
[0010]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0011]第一方面，本专利技术提供一种具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料的制备方法，其包括：
[0012]对SIRPα的全长碱基序列进行定点突变，得到突变体M
‑
SIRPα的碱基序列；
[0013]将荧光标记蛋白的碱基序列连接到突变体M
‑
SIRPα的碱基序列上，得到融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F；
[0014]利用表达质粒构建含有融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F的重组质粒；
[0015]将重组质粒转染至宿主细胞，并进行抗性筛选，得到能够稳定将突变体M
‑
SIRPα表达于细胞膜表面的重组细胞；
[0016]将重组细胞扩大培养后，提取含有突变体M
‑
SIRPα的细胞膜材料。
[0017]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述突变体M
‑
SIRPα中至少有9个氨基酸发生突变；
[0018]优选地，突变体M
‑
SIRPα的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述在构建融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F过程中，荧光标记蛋白的碱基序列是通过linker连接到突变体M
‑
SIRPα的碱基序列上的；
[0020]优选地，linker的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
[0021]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述荧光标记蛋白包括红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、橙色荧光蛋白和黄色荧光蛋白中的任一种。
[0022]优选地，荧光标记蛋白为红色荧光蛋白，融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
[0023]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述在构建重组质粒的过程中，表达质粒包括pCMV3、pCMV6、pcDNA3.1和pGL4.50中的任一种；
[0024]优选地，将融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F连接到pCMV3上，连接位点为Hind III和Xba I。
[0025]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述在构建重组细胞的过程中，宿主细胞包括HEK 293T、CHO、NS0、BHK和PER
‑
C6细胞中的任一种；
[0026]优选地，采用潮霉素B对宿主细胞进行抗性筛选；
[0027]优选地，潮霉素B的浓度为380～420μg/mL。
[0028]第二方面，本专利技术提供一种根据上述制备方法制得的具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料。
[0029]第三方面，本专利技术提供一种上述具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料在制备靶向肿瘤药物或诊断试剂中的应用。
[0030]第四方面，本专利技术提供一种治疗或诊断肿瘤的靶向药物递送系统，该靶向药物递送系统包括上述细胞膜材料，肿瘤为可以表达CD47的肿瘤。
[0031]第五方面，本专利技术提供一种靶向肿瘤药物，其特征在于，其包括活性药物分子、以及包裹在活性药物分子外的细胞膜材料，细胞膜材料由上述制备方法制得。
[0032]与现有技术相比，本专利技术至少具有如下技术效果：
[0033]本专利技术通过基因工程的手段将突变型的SIRPα表达于宿主细胞膜表面，可获得对肿瘤细胞表面CD47配体有主动靶向结合能力的细胞膜材料。利用该细胞膜材料对抗肿瘤纳米药物进行表面修饰，可实现高效递送药物至肿瘤部位；同时，通过竞争性结合肿瘤细胞表面的CD47配体，从而阻断巨噬细胞表面的SIRPα受体与CD47配体结合，进而恢复巨噬细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料的制备方法，其特征在于，其包括：对SIRPα的全长碱基序列进行定点突变，得到突变体M
‑
SIRPα的碱基序列；将荧光标记蛋白的碱基序列连接到所述突变体M
‑
SIRPα的碱基序列上，得到融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F；利用表达质粒构建含有所述融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F的重组质粒；将所述重组质粒转染至宿主细胞，并进行抗性筛选，得到能够稳定将所述突变体M
‑
SIRPα表达于细胞膜表面的重组细胞；将所述重组细胞扩大培养后，提取含有突变体M
‑
SIRPα的细胞膜材料。2.根据权利要求1所述的具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料的制备方法，其特征在于，所述突变体M
‑
SIRPα中至少有9个氨基酸位置发生碱基突变；优选地，所述突变体M
‑
SIRPα的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料的制备方法，其特征在于，在构建所述融合碱基序列M
‑
SIRPα
‑
F过程中，所述荧光标记蛋白的碱基序列是通过linker连接到所述突变体M
‑
SIRPα的碱基序列上的；优选地，所述linker的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的具有高亲和力结合肿瘤细胞CD47的细胞膜材料的制备方法，其特征在于，所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱志勇，杨云，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：