一株抗烟酰胺单核苷酸胁迫的大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株抗烟酰胺单核苷酸胁迫的大肠杆菌及其应用，属于微生物工程技术领域。该菌株为大肠杆菌ME59，已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222060。本发明专利技术提供的抗烟酰胺单核苷酸(NMN)胁迫的菌株兼具优异的抗NMN性能和高NMN产率，一方面，在非烟酰胺单核苷酸胁迫情况下，菌株ME59相比出发菌株具有更高的NMN产量，另一方面，菌株ME59克服了出发菌株的NMN耐受性低的问题，能够在高NMN浓度下仍保持较高的存活率和NMN产量，提供了一种高产率NMN工程菌株。工程菌株。工程菌株。

【技术实现步骤摘要】
16.4g/L、硫酸铵7g/L、酵母粉10g/L、一水柠檬酸1.1g/L、维生素B
1 0.1g/L、烟酰胺1
‑
10g/L，其中烟酰胺补料培养基200g/L，以5mL/h流加补料。
[0026]更优选的，所述发酵培养基中含有卡纳霉素50μg/μL、链霉素50μg/μL。
[0027]另一方面，本申请还提供了一种上述的方法发酵制得的烟酰胺单核苷酸。
[0028]另一方面，本申请还提供了一种组合物，所述组合物包含上述的烟酰胺单核苷酸。
[0029]另一方面，本申请还提供了上述的大肠杆菌或上述的微生物制剂或上述的烟酰胺单核苷酸或上述的组合物在化学领域、制药领域和/或化妆品领域中的应用。
[0030]在一种优选的实施方式中，一种获得抗烟酰胺单核苷酸胁迫菌株的方法包括如下步骤：
[0031]步骤一、取出发菌株添加到含烟酰胺单核苷酸的培养基中进行多轮转接培养，同时随传代数的增加逐步在培养基中提高烟酰胺单核苷酸的浓度，获得进化群体；
[0032]步骤二、采用细胞分选技术对所述进化群体进行单细胞分选，最终获得驯化菌株。
[0033]其中，直至菌株在同一烟酰胺单核苷酸胁迫浓度下OD
600
达到出发菌株未胁迫情况下的对数生长的中后期的OD
600
值，即可转接至下一浓度的培养基中。
[0034]采用产NMN的工程菌NMN02作为出发菌株，关于该菌株内容具体可见申请号为202210781815.2的专利文件一种生产NMN的重组大肠杆菌及其应用。r/>[0035]本专利技术具有如下有益效果：
[0036]1、本申请提供了一株抗NMN胁迫的大肠杆菌ME59，其兼具优异的生长趋势、抗NMN性能和高NMN产率，一方面，在非烟酰胺单核苷酸胁迫情况下，本申请所述大肠杆菌ME59相比出发菌株具有更好的生长趋势和更高的NMN产量，其中，发酵培养24h左右时其OD
600
达到110左右，比出发菌株提高了2.4倍，表现出优异的生长能力，NMN产量相对出发菌株提高了13％。另一方面，本申请提供的ME59菌株克服了出发菌株的NMN耐受性低的问题，能够在高NMN浓度下仍保持较高的存活率和NMN产量，存活率可达出发菌株的21倍，提供了一种适用于工业生产的高NMN产率新菌株；
[0037]2、本申请中还提供了一种获得抗烟酰胺单核苷酸胁迫菌株的方法，通过适应性实验室进化的方法驯化NMN工程菌，具有适用性广泛及实用性强的优点。
附图说明
[0038]此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0039]图1为NMN02添加不同浓度NMN的生长曲线图；
[0040]图2为产NMN工程菌株NMN02生长曲线图；
[0041]图3为NMN驯化菌株群体的生长情况图；
[0042]图4为深孔板中93株NMN驯化菌的OD
600
与出发菌株对比图，其中，左图为24h OD
600
，右图为48h OD
600
；
[0043]图5为菌体密度增长量前15个菌株统计图；
[0044]图6为24h时十株NMN驯化菌OD
600
与出发菌株NMN02的对比图；
[0045]图7为24h时十株NMN驯化菌的NMN产量与出发菌株NMN02的对比图；
[0046]图8为ME59在5L罐中的发酵过程图；
[0047]图9为驯化菌株和对照菌株在40g/L的NMN胁迫培养的存活率(％)图。
[0048]生物材料保藏：
[0049]一株大肠杆菌ME59，已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222060，保藏地址为中国湖北省武汉市，武汉大学。
具体实施方式
[0050]为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本专利技术更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本专利技术可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本专利技术发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
[0051]实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0052]其中，所述出发菌株采用记载于申请号为202210781815.2的专利文件中构建的菌株NMN02。
[0053]如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0054]在进一步描述本专利技术具体实施方式之前，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0055]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。
[0056]除非另外说明，本专利技术中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
常规的微生物学、生物化学、分析化学、细胞培养及相关领域的常规技术。
[0057]本申请中采用产NMN的工程菌NMN02作为出发菌株(已记载于申请号为202210781815.2的专利文件)。本申请中发现，若采用该出发菌株直接进行NMN生产，则会由于该菌株对产物NMN的耐受性较低，当发酵液中NMN浓度达到15g/L时，菌体生长相比没有NMN存在的情况下被抑制50％。在不同浓度的NMN添加下测定菌株NMN02的生长曲线，结果如图1所示，在高NMN环境中，菌株NMN02的生长明显被抑制。
[0058]本申请中通过将出发菌株在含有NMN的培养基中进行连续传代，同时逐步在培养基中提高NMN的浓度，胁迫底盘细胞定向进化，获得兼具优异的抗NMN性能和高NMN产率的新的工程菌。
[0059]产NMN菌株NMN02在之前的发酵过程中，NAM一次补料的最大浓度为8g/L，NMN的产量最大可达20g/L，因此可以认为传代到底盘细胞在30g/L NMN培养基条件下，生长基本不被抑制为进化终点。
[0060]本申请中通过细胞分选技术，对进化群体进行单细胞分选。在96孔板上进行初筛，通过检测在含有30g/L NMN的培养条件下各单细胞生长情况，分别挑选生长最好的10株菌，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株抗烟酰胺单核苷酸胁迫的大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌ME59，已于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20222060。2.权利要求1所述的大肠杆菌在发酵生产烟酰胺单核苷酸中的应用。3.一种含有如权利要求1所述的大肠杆菌的微生物制剂。4.权利要求3所述的微生物制剂在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。5.一种发酵生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的菌株或如权利要求3所述的微生物制剂发酵生产烟酰胺单核苷酸。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养方法包括：以烟酰胺作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟平，高萌，王瑞妍，张天萌，张晨，
申请(专利权)人：江苏华熙益能生物科技有限公司华熙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：