CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法技术

一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，基于CRISPR/Cas13a系统和杂交链反应(HCR)的流感H1N1病毒检测比色生物传感器提供了概念验证。流感H1N1病毒的靶RNA激活了Cas13a的反式裂解活性，它裂解了探针的特殊RNA序列(

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法


[0001]本专利技术属于病毒检验检测
，涉及一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法。

技术介绍

[0002]流感病毒是一种包膜、分段、负链、单链RNA病毒。大多数温血动物都可以成为流感病毒的宿主，历史上曾引起许多大流行，在世界范围内有相当高的发病率和死亡率。目前，流感病毒包括A、B、C、D型。甲型流感病毒是最严重和最致命的病毒。在一年内，这种病毒传播到214个国家，造成全球超过18000人死亡，并已成为一个主要的国际公共卫生问题。
[0003]病毒的分离和培养是诊断流感病毒的金标准。但目前由于逆转录酶聚合酶链反应(RT
‑
PCR)的优越的分析性和敏感性，其取代病毒分离培养成为新一代的金标准。同时，几种传统的检测方法被广泛应用于流感病毒的检测，包括ELISA和蛋白质鉴定。随着时间的推移，流感病毒的传统检测技术有所改进。然而，该方法也有一些固有的缺点。它的操作很复杂，需要经过专业训练的人员或复杂的实验室仪器。因此，该技术不适用于常规医疗保健和资源贫乏地区。已经发展了许多检测流感病毒的新方法，包括电化学免疫传感器，表面增强拉曼散射成像适应传感器平台，荧光，比色和微流控芯片方法。其中，比色法是一种快速、方便的选择，不需要先进的仪器。
[0004]有规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是大多数古细菌(约87％)和细菌(约47％)源于防御病毒DNA或RNA的需要，已经进化出的一个免疫反应系统。完整的CRISPR基因组中包含一系列CRISPR阵列、CRISPR相关(Cas)蛋白基因和由不同间隔区隔开的直接重复序列。随着病毒的出现，CRISPR
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Cas位点会触发“适应
‑
表达
‑
干扰”的三阶段免疫反应，破坏宿主细胞内的噬菌体入侵。目前CRISPR/Cas9研究得最为清楚，其防御过程主要为三阶段：CRISPR捕获序列间隔序列、合成成熟的CRISPR RNA、靶标干扰后定向切割。CRISPR/Cas13a(C2c2)是张锋小组在2016年首次描述了一种靶向RNA的CRISPR相关酶，与II类中的其他Cas蛋白相比，Cas13a对单链RNA(ssRNA)具有顺式和反式切割活性，Cas13a能够切割和修剪pre
‑
crRNA以产生成熟的crRNA。CRISPR/Cas系统因识别精确性，高效性和简便性等优点，目前已广泛应用于农业、生物、化学等各种领域。
[0005]为了进一步提高分析性能，Cas13a系统已与多种信号扩增技术相结合，如滚动环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增(LAMP)，其中一些等温核酸扩增技术采用昂贵的酶，有些由于需要逆转录，操作繁琐，杂交链反应(HCR)是由Dirks和Pierce介导的链置换反应，HCR是一种无酶、熵驱动、等温的自发DNA组装过程。一个普通的HCR需要三个成分，包括一个DNA启动子和两个DNA发夹，特别是两个稳定的DNA发夹在溶液中共存，直到一个启动子链被引入后第一个发夹被打开。二级结构的丢失导致了第二个类似的发夹的打开。这个过程是一系列的DNA组装事件。最终，HCR形成了一个具有许多重复单元的缺口双
螺旋结构。与PCR相比，HCR用于等温核酸扩增，不需要繁琐的温度变化。与RCA和LAMP相比，HCR不需要酶和复杂的引物设计。
[0006]辣根过氧化物酶模拟DNAzyme(HRP
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DNAzyme)来结合Cas13a和HCR。HRP
‑
DNAzyme是生物传感器和生物识别技术中最常用的催化DNAzymes之一。单链富含鸟嘌呤的核酸和血红素复合物成分相互作用，催化过氧化氢(H2O2)和2,2
‘‑
叠氮
‑
双(3
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乙基
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苯并噻唑啉)
‑6‑
磺酸(ABTS2‑
)之间的氧化还原反应，并伴随颜色变化。这种方法不需要繁琐的仪器和昂贵的改良探针(如荧光团、猝灭剂、亚甲基蓝等)。以实现分析物识别事件的转导到一个光学检测模式。该比色生物传感器放大信号，降低实验条件，以达到视觉检测流感H1N1的目的。我们观察到比色生物传感器在10pM到100nM之间存在良好的线性关系，检测限为0.152pM。由于Cas13a具有突出的选择性，因此在扩增反应中可以排除其它靶标外的甲型流感病毒亚型。本文提供的数据表明，这种基于Cas13a的比色生物传感器是一种很有前途的生物分析的分析方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供了一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，该方法不需要改变温度环境，快速高效，对病毒的生物学检测具有重要的应用价值。
[0008]本专利技术的CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，步骤如下：
[0009]通过比色生物传感器识别H1N1，并通过CRISPR/Cas13a蛋白系统保证反应的特异性。从H1N1流感病毒中提取的靶RNA进入CRISPR/Cas13a蛋白内部后，通过碱基互补配对与crRNA结合。这改变了蛋白质的结构，并激活了CRISPR/Cas13a蛋白的反式切割能力。设计了一个含有三个尿苷单磷酸的DNA核苷酸链(探针I)。该探针被设计为Cas13a/crRNA反式裂解的底物。DNA探针I由5
′
端的I1链、中间的一个特殊的RNA序列(
‑
UUU
‑
)和3
′
端的I2链组成。用生物素修饰I1链，使该链能够启动HCR反应。该特殊的RNA序列(
‑
UUU
‑
)被CRISPR/Cas13a系统识别和切割。Cas13a被激活并裂解探针I的RNA序列，探针I分离成I1和I2链。加入SA
‑
MBs，生物素与SA相互作用。含有生物素的未裂解探针I和I1链被SA
‑
MBs吸附，然后通过磁分离将其从溶液中去除。加入发夹H1和H2后，I2链与H1结合，通过趾点介导的链置换打开H1发夹。I2‑
H1复合物的杂交打开了H2的发夹结构。打开的H2链与发夹H1链互补，导致H1链的发夹结构打开，从而引发HCR反应。由于H1和H2发夹结构不断地打开和组装，H1的g
‑
四联体片段暴露出来。
[0010]随后，在血红素的存在下，g
‑
四联体结构折叠，血红素插入到该结构中，形成一个DNAzyme。g
‑
四联体DNAzyme可以催化ABTS2‑
和H2O2之间的氧化还原反应。ABTS溶液的颜色由浅绿色变成深绿色。由此开始的比色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于步骤如下：通过比色生物传感器识别H1N1，并通过CRISPR/Cas13a蛋白系统保证反应的特异性；从H1N1流感病毒中提取的靶RNA进入CRISPR/Cas13a蛋白内部后，通过碱基互补配对与crRNA结合；这改变了蛋白质的结构，并激活了CRISPR/Cas13a蛋白的反式切割能力；创建了一个含有三个尿苷单磷酸的DNA核苷酸链(探针I)；该探针被设计为Cas13a/crRNA反式裂解的底物；DNA探针I由5
′
端的I1链、中间的一个特殊的RNA序列(
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)和3
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端的I2链组成；用生物素修饰I1链，使该链能够启动HCR反应；该特殊的RNA序列(
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)被CRISPR/Cas13a系统识别和切割；Cas13a被激活并裂解探针I的RNA序列，探针I分离成I1和I2链；加入SA
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MBs，生物素与SA相互作用；含有生物素的未裂解探针I和I1链被SA
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MBs吸附，然后通过磁分离将其从溶液中去除；加入发夹H1和H2后，I2链与H1结合，通过趾点介导的链置换打开H1发夹；I2‑
H1复合物的杂交打开了H2的发夹结构；打开的H2链与发夹H1链互补，导致H1链的发夹结构打开，从而引发HCR反应；由于H1和H2发夹结构不断地打开和组装，H1的g
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四联体片段暴露出来；随后，在血红素的存在下，g
‑
四联体结构折叠，血红素插入到该结构中，形成一个DNAzyme；g
‑
四...

【专利技术属性】
技术研发人员：万家余，李忠义，郝镯，刘文森，董明鑫，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所，
类型：发明
国别省市：