抗虫蛋白Cry1F酶联免疫定量检测试剂盒及方法技术

一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，从而具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。高特异性的特点。高特异性的特点。

【技术实现步骤摘要】
抗虫蛋白Cry 1F酶联免疫定量检测试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及到一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ
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内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入多种农作物使其具有抗虫性。Cry 1F蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、玉米、棉花等。
[0003]转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中Cry 1F蛋白进行快速的定量分析，研究开发Cry 1F酶联免疫试剂盒具有非常大的意义。r/>
技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry1F的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。
[0006]其中，样品处理液的配方为：
No.45008的杂交瘤细胞株1D7 1C6分泌得到的，1D7 1C6作为捕获抗体检测范围：0.3125ng/mL
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2.5ng/mL。
[0021]上述酶联免疫试剂盒在另一种实施方式中，所述检测抗体由保藏号为CGMCC No.45009的杂交瘤细胞株1F7 1D8分泌得到。
[0022]所述的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8是用转基因玉米中抗虫蛋白Cry1F免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。
[0023]本专利技术还提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0024]1)将上述样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液置于18
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25℃，平衡至少30分钟；
[0025]2)分别设标准品孔、待测样本孔，在每孔中加入标准品或待测样本进行温育，然后弃去液体，加入生物素标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液，进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值；
[0026]3)数据处理：将标准品及样本值减去S0孔数值后绘制曲线，如果设置复孔，则取其平均值计算，以标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，在对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样本OD值，由标准曲线查出相应的浓度。
[0027]上述检测方法在另一种实施方式中，生物素标记的检测抗体工作液是通过将生物素标记的检测抗体液用生物素标记的抗体稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。
[0028]浓缩洗涤液：洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶；洗液工作液：将浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240mL去离子水，倒入浓烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。
[0029]上述检测方法在另一种实施方式中，辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液是通过将辣根过氧化物酶标记的亲和素用辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液按1:100倍进行稀释得到的，如10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。
[0030]上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本80
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120μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育1.5
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2.5小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素标记抗体工作液80
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120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5
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1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板2
‑
4次，每次浸泡1
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3分钟，150
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250μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液80
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120μL，覆上新的板贴，37℃温育0.5
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1.5小时；弃去孔内液体，甩干，洗板4
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6次，每次浸泡1
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3分钟，150
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250μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液80
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100μL，37℃避光显色15
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30分钟；依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。
[0031]上述检测方法在另一种实施方式中，在步骤2)中，每孔分别加标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时；弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加生物素
标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡2分钟，200μL/每孔，甩干；依序每孔加底物溶液90μL。
[0032]上述检测方法在另一种实施方式中，所述检测方法为ELISA双抗体夹心方法。
[0033]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术试剂盒是一种基于ELISA双抗体夹心方法的检测试剂盒，成本低，主要试剂均以工作液形式提供，操作简便，能同时快速检测大批样品；具有高灵敏度、高特异性的特点；也是目前国内乃至国本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成；其中，样品处理液为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA 20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的Cry 1F 1F7 1D8鼠单抗，鼠单抗溶液即PBS,50％甘油溶液；标准品：2.5ng的His
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Cry 1F重组蛋白；辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA 1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN
3 0.1mL，最终用1
×
PBS定容至100mL；浓缩洗涤液：含有1.0％Tween
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20的10
×
PBS；底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H2O2混合，现用现配；终止液：1M H2SO4。2.根据权利要求1所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的捕获抗体由保藏号为CGMCC No.45008的杂交瘤细胞株1D7 1C6分泌得到的，捕获抗体的检测范围0.3125ng/mL
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2.5ng/mL；所述检测抗体由保藏号为CGMCC No.45009的杂交瘤细胞株1F7 1D8分泌得到。3.根据权利要求1所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述His
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Cry 1F重组蛋白是通过将Cry 1F编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a
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Cry 1F转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Cry 1F表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到。4.根据权利要求2所述定量检测转基因玉米中抗除草剂蛋白Cry 1F的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株1D7 1C6和1F7 1D8是用转基因玉米中抗虫蛋白Cry 1F免疫BALB/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞与商品化的小鼠杂交瘤细胞SP2/0融合，用HAT培养基筛选得到。5.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：金芜军，刘卫晓，苗朝华，宛煜嵩，孟丽霞，董美，高进，王迪，赵伟玲，文婷婷，王占超，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：