一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法技术

本发明专利技术公开了一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，该方法包括如下步骤：合成光交联材料、水凝胶前体溶液的制备、细胞悬液的准备、含细胞水凝胶的制备和3D细胞培养。本发明专利技术所述光交联水凝胶能够实现快速凝胶化，有效避免了细胞在交联过程中的沉降，得到细胞分布均匀的水凝胶，同时所得水凝胶在3D细胞培养期间性质稳定；此外，基于光交联水凝胶的3D细胞培养过程对细胞无毒害作用，细胞在3D培养期间存活率高、增殖能力好。因此，本发明专利技术开发了一种交联速度快、生物相容性好、凝胶稳定性好的水凝胶材料用于皮肤细胞的3D培养。水凝胶材料用于皮肤细胞的3D培养。水凝胶材料用于皮肤细胞的3D培养。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法


[0001]本专利技术涉及一种皮肤细胞3D培养方法，具体涉及一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法。

技术介绍

[0002]在化妆品原料的开发过程中，2D皮肤细胞广泛应用于化合物的功效筛选和作用机制研究，但2D培养的细胞缺少生理状态下的组织架构、细胞
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细胞之间以及细胞
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细胞外基质之间的相互作用。由于培养空间有限，细胞一旦融合就会停止生长，导致2D细胞模型可用时间短，只能用来评价化妆品原料的短期效果。相比之下，3D细胞培养为细胞提供三维生长环境，在一定程度上模拟体内环境，使皮肤细胞在增殖、分化、形态和功能方面更加接近生理状态。同时三维环境中细胞生长的持续时间长，有望用于化妆品原料更长时间的功效评价。
[0003]3D细胞培养体可以是自发聚集的细胞球体、接种在支架上或者包封在支架内的细胞。细胞球体无需外源性基质的添加，制造方法简单，但由于球体中心缺乏气体和营养交换，不利于细胞的长期生存，另外其球体的大小和结构也难以控制。基于支架的3D细胞培养有两种基本策略，一种是将细胞接种于制作好的支架上，这种策略依赖于细胞在支架上的自主迁移，存在细胞分布不均匀的问题。第二种策略是将基质材料与细胞混合在一起，通过特定的交联方式形成稳定的三维结构。这种策略能够在交联的开始阶段保证细胞与基质分布均匀，但交联时间长短、基质的溶胀和降解情况等会影响细胞和基质的空间分布。为了避免交联时间过长导致的细胞空间分布不均匀，需要选择合适的交联方式，缩短交联时间。
[0004]水凝胶的特性类似细胞外基质，能够为细胞提供高度水合的、机械强度高的三维环境，同时对氧气、营养物质和其他水溶性化合物具有高度的渗透性，是3D细胞培养的最佳候选材料。许多天然和合成水凝胶已经应用于细胞的3D培养，其中以天然水凝胶的应用最为广泛。胶原蛋白也是由成纤维细胞合成的蛋白质，约占人体蛋白质总量的30％以上，胶原蛋白是皮肤重要的结构蛋白，赋予皮肤细胞外基质强度，还具有丰富的黏附信号分子。目前，Ⅰ型胶原蛋白是皮肤细胞3D培养和皮肤组织工程领域最常用的基质材料，一般借助于胶原蛋白的自组装形成凝胶，但这种物理交联方式需要材料和细胞混合后静置30分钟到1小时才能成胶，此过程不可避免地导致细胞的沉降聚集，由此带来细胞分布不均的现象。此外物理交联形成的水凝胶还存在交联度低、机械性能差、降解速度快等缺点。为了解决上述问题，有研究采用化学交联的方式对胶原蛋白进行交联，但传统的化学交联会引入化学交联剂，对细胞有一定的毒性。因此，寻找一种交联速度快、生物相容性好、凝胶稳定性好的交联方式，对于皮肤细胞3D培养尤为重要。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术旨在提供一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，所述方法能够实现快速凝胶化，得到细胞分布均匀、性质稳定的水凝胶，而且不会对凝胶中的细
胞产生毒性，可以用于皮肤细胞的3D培养。
[0006]技术方案：本专利技术所述基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，包括如下步骤：
[0007](1)合成光交联材料：所述光交联材料为双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白或双键修饰的透明质酸；
[0008](2)水凝胶前体溶液的制备：将光引发剂溶液与光交联材料溶液混合，静置，得到水凝胶前体溶液；
[0009](3)细胞悬液的准备：皮肤细胞置于培养箱内培养，细胞密度达到80
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90％时消化，得到用于3D细胞培养的细胞悬液；
[0010](4)含细胞水凝胶的制备：将上述水凝胶前体溶液与细胞悬液混合均匀，光照条件下反应得到含细胞水凝胶；
[0011](5)3D细胞培养：向得到的含细胞水凝胶中添加细胞培养基，置于培养箱内培养，最终得到3D细胞培养产物。
[0012]进一步的，所述步骤(1)中Ⅰ型胶原蛋白为从鼠尾、牛跟腱、牛骨、牛皮、鱼皮或猪皮中提取的Ⅰ型胶原蛋白以及重组Ⅰ型胶原蛋白。
[0013]进一步的，步骤(1)中所述光交联材料的合成过程为：
[0014]双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白：将Ⅰ型胶原蛋白与甲基丙烯酸酐按照1:1
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1.035的质量比混合，于2
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6℃反应12
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72小时，获得双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白(CMA)；
[0015]双键修饰的透明质酸：将透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照1:6.5
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8.5的质量比混合，于10
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30℃反应12
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48小时，获得双键修饰的透明质酸(GMHA)。
[0016]更进一步的，所述步骤(1)中双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白的具体合成方法如下：
[0017]a)称取Ⅰ型胶原蛋白，加入4℃预冷的0.1
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0.5M冰醋酸，置于低温恒温搅拌反应器上，4℃下缓慢搅拌直至完全溶解，得到3.5
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4.5mg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液；
[0018]b)向上一步得到的Ⅰ型胶原蛋白溶液中滴加4℃预冷的1
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2M氢氧化钠，调节体系的pH为7
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9，按照Ⅰ型胶原蛋白与甲基丙烯酸酐的质量比为1:1
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1.035向体系中滴加一定体积的甲基丙烯酸酐，2
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6℃下反应12
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72小时；
[0019]c)将上一步的反应液转移到截留分子量为3500
‑
14000kDa透析袋中，转移到4℃的0.02M冰醋酸中透析2
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4天，冷冻干燥，得到双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白。
[0020]更进一步的，所述步骤(1)中双键修饰的透明质酸的具体合成步骤如下：
[0021]a)称取透明质酸，加入PBS，10
‑
30℃条件下搅拌至完全溶解，得到5
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15mg/mL的透明质酸溶液；
[0022]b)向上一步得到的透明质酸溶液中依次加入三乙胺、四丁基溴化铵和甲基丙烯酸缩水甘油酯，使透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯的质量比为1:6.5
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8.5，三乙胺、四丁基溴化铵与甲基丙烯酸缩水甘油酯的比例为1mL:1g:1mL，10
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30℃下搅拌反应12
‑
48小时；
[0023]c)除去过量反应物，随后干燥得到双键修饰的透明质酸。
[0024]优选的，双键修饰的透明质酸的具体合成步骤c)中除去过量反应物的两种方案为：方案一：按照反应液与丙酮的体积比为1:5
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10，将反应液滴加到丙酮中，收集沉淀，烘干得到双键修饰的透明质酸；方案二：将反应液转移到截留分子量为3500
‑
14000kDa透析袋中，转移到纯水中透析2
‑
4天，冷冻干燥，得到双键修饰的透明质酸。
[0025]进一步的，所述步骤(1)中双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白，其接枝率为5
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60％，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成光交联材料：所述光交联材料为双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白或双键修饰的透明质酸；(2)水凝胶前体溶液的制备：将光引发剂溶液与光交联材料溶液混合，静置，得到水凝胶前体溶液；(3)细胞悬液的准备：皮肤细胞置于培养箱内培养，细胞密度达到80
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90％时消化，得到用于3D细胞培养的细胞悬液；(4)含细胞水凝胶的制备：将上述水凝胶前体溶液与细胞悬液混合均匀，光照条件下反应得到含细胞水凝胶；(5)3D细胞培养：向得到的含细胞水凝胶中添加细胞培养基，置于培养箱内培养，最终得到3D细胞培养产物。2.根据权利要求1所述的基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述的Ⅰ型胶原蛋白为从鼠尾、牛跟腱、牛骨、牛皮、鱼皮或猪皮中提取的Ⅰ型胶原蛋白以及重组Ⅰ型胶原蛋白。3.根据权利要求1所述的基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述光交联材料的合成过程为：双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白：将Ⅰ型胶原蛋白与甲基丙烯酸酐按照1:1
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1.035的质量比混合，于2
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6℃反应12
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72小时，获得双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白；双键修饰的透明质酸：将透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯按照1:6.5
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8.5的质量比混合，于10
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30℃反应12
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48小时，获得双键修饰的透明质酸。4.根据权利要求1所述的基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述双键修饰的Ⅰ型胶原蛋白的接枝率为5
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60％，双键修饰的透明质酸的接枝率为5
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80％。5.根据权利要求1所述的基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述光引发剂是LAP或I2959。6.根据权利要求1所述的基于光交联水凝胶的皮肤细胞3D培养方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄庆，李慧娟，迟百怡，吴建新，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：