一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体是一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。本发明专利技术提供的方法能够得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹。该方法生产无有机溶剂、无环境污染，生产成本低。本发明专利技术提供的超小分子量透明质酸钠，其寡糖以二糖、四糖和六糖为主，含有少量八糖，无细胞毒性，透皮吸收性好，还具有无细胞毒性、促进紧致、抗皱等优点。实验表明，采用本发明专利技术所述的方法成功得到所述超小分子量透明质酸钠，产率达到了89.6％；经过测试，其在2.00％(m/V)浓度范围内未表现出成纤维细胞毒性，完全透皮时间为2h，具有较好的紧致和抗皱功效。抗皱功效。

【技术实现步骤摘要】
一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体是一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid，HA)是一种酸性黏多糖，是由N乙酰葡糖胺和D葡糖醛酸双糖重复单位通过β(1
→
4)糖苷键和β(1
→
3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，存在于动物组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。透明质酸广泛用于医药、化妆品、食品等领域，分子量一般为105～107道尔顿(Da)。
[0003]不同分子量的透明质酸表现出不同的生物活性，低分子量透明质酸甚至表现出与高分子量透明质酸完全相反的活性。很多文献都对透明质酸在创伤修复中发挥的作用进行了报道，尤其是低分子量及透明质酸寡糖作为活性物质受到更多关注。
[0004]专利CN 112553273 A公开了一种酶解超小分子量透明质酸钠的制备方法，该方法酶解后纯化采用板框过滤、絮凝剂除杂、浓缩采用减压浓缩方法成本及能耗高。
[0005]专利CN 113801904 A公开了一种酶解透明质酸寡糖组合物的方法，该方法所用透明质酸酶为参照CN 103695448 A中的方法，该酶是利用DEAE纤维素柱纯化的，酶的纯化成本高，且纯化的酶是否含有分子量较小杂质、其该酶解透明质酸寡糖组合物的制备方法是否引入酶液中额外分子量较小杂质尚未可知，该寡糖组合物并未对产品质量说明；酶解后采用截留分子量600Da
‑
1000Da超滤膜分离在工业放大中效率、产品得率尚未可知；
[0006]专利CN 103484513A公开了一种透明质酸制备四糖、六糖、八糖、十糖等特定小分子透明质酸的方法，该方法是利用经镍柱纯化的纯酶来酶解的，酶的成本高。该方法酶解反应体系小，放大后的酶解效果尚未可知。
[0007]专利CN 101123942A的透明质酸分子量约为0.7MDa～0.9MDa，具有保湿和抗皱效果，但其菌体来源与透明质酸钠分子量及制备工艺与本专利完全不一样。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种超小分子量透明质酸钠及其制备方法，本专利技术提供的方法能够制备得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹。
[0009]本专利技术提供了一种超小分子量透明质酸钠，以质量份计，其寡糖成分包括：
[0010]7份～9份的二糖；
[0011]60份～70份的四糖；
[0012]20份～30份的六糖；和
[0013]0.6份～1.2份的八糖。
[0014]本专利技术提供的超小分子量透明质酸钠，其寡糖以二糖、四糖和六糖为主，含有少量八糖，无细胞毒性，相比市售寡聚透明质酸钠(平均分子量为3000Da～10000Da)的透皮吸收性好，还具有无细胞毒性、促进Ⅰ型胶原蛋白生成、人体上改善皮肤皱纹等优点。
[0015]本专利技术提供的超小分子量透明质酸钠，其质量标准高于市售超小分子量透明质酸钠，体现在本专利技术所述超小分子量透明质酸钠的含量为95wt％以上，蛋白含量小于0.05wt％，高于市售超小分子量透明质酸钠的含量为93wt％以上，蛋白含量小于0.1wt％。其平均分子量小于市售超小分子量透明质酸钠，所述市售超小分子量透明质酸钠的平均分子量小于1000Da，为600Da～800Da，而本申请提供的超小分子量透明质酸钠的平均分子量为300Da～400Da。
[0016]本专利技术提供了一种上述超小分子量透明质酸钠的制备方法，包括以下步骤：
[0017]S1)将透明质酸钠用纯化透明质酸酶进行酶解反应，得到酶解反应物；
[0018]S2)将步骤S1)中所述酶解反应物进行超滤分离，得到总透过液；
[0019]S3)将步骤S2)中所述总透过液依次进行钠滤浓缩和除杂，得到上述超小分子量透明质酸钠。
[0020]本专利技术所述纯化透明质酸酶是由透明质酸酶经过纯化得到的，所述纯化的方法有很多种，应用不同的纯化方法所得到的纯化透明质酸酶用于透明质酸钠的酶解所能达到的效果各不相同。本申请专利技术人创造性地发现，本专利技术所述纯化透明质酸酶通过特定的纯化方法将透明质酸酶纯化所得到，不仅成本低廉，而且将其用于透明质酸钠的酶解反应，能够制备得到平均分子量约为300Da～400Da的超小分子量透明质酸钠，产品得率高；其透皮吸收性好，能够改善人体皮肤皱纹，而且还通过了人体测试。
[0021]本专利技术所述纯化透明质酸酶的纯化方法包括：将透明质酸酶发酵液依次进行板框除菌、低压陶瓷膜除菌和高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。具体而言，本专利技术将透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。
[0022]本专利技术所述透明质酸酶的来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％，优选为1wt％～5wt％。在本专利技术的某些实施例中，所述透明质酸酶清液的酶活为1.2
×
106U/mL～1.6
×
106U/mL。
[0023]本专利技术所述纯化透明质酸酶的纯化方法首先将透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液。本专利技术对所述板框除菌的方法无特殊限制，为本领域技术人员熟知的板框除菌的方法。
[0024]本专利技术得到透明质酸酶清液后，将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液。具体而言，本专利技术将所述透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌后，还包括采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸液。在一个实施例中，所述低压陶瓷膜的规格为50nm～200nm，优选为200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.3Mpa～0.35Mpa，料液温度为30℃～35℃。在一个实施例中，所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液的酶活为5
×
105U/mL～7
×
105U/mL。在一个实施例中，所述缓冲盐为1wt％～3wt％的氯化钠溶液。
[0025]本专利技术得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液后，将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。具体而言，将所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂后，还包括采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，得到所述纯化透
明质酸酶。在一个实施例中，所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000Da～25000Da，优选为15000Da；所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.5Mpa～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70Mpa～0.75Mpa，料液温度为30℃～35℃。在一个实施例中，所述缓冲盐为1wt％～本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超小分子量透明质酸钠，其特征在于，以质量份计，其寡糖成分包括：7份～9份的二糖；60份～70份的四糖；20份～30份的六糖；和0.6份～1.2份的八糖。2.根据权利要求1所述的超小分子量透明质酸钠，其特征在于，其平均分子量为300Da～400Da。3.一种权利要求1或2所述的超小分子量透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1)将透明质酸钠用纯化透明质酸酶进行酶解反应，得到酶解反应物；S2)将步骤S1)中所述酶解反应物进行超滤分离，得到总透过液；S3)将步骤S2)中所述总透过液依次进行钠滤浓缩和除杂，得到所述超小分子量透明质酸钠。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纯化透明质酸酶的纯化方法包括：将透明质酸酶发酵液依次进行板框除菌、低压陶瓷膜除菌和高压陶瓷超滤膜除杂，得到所述纯化透明质酸酶。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述纯化透明质酸酶的来源为水蛭；步骤S1)中所述透明质酸酶发酵液中菌体的质量含量为50wt％～55wt％。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1)中所述低压陶瓷膜的规格为50nm～20...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕延凯，颜少慰，张廷志，向静，
申请(专利权)人：水羊化妆品制造有限公司，
类型：发明
国别省市：