基因编辑细胞脱靶检测的方法技术

本发明专利技术提出了基因编辑细胞脱靶检测的方法，所述方法包括：(1)对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白

【技术实现步骤摘要】
基因编辑细胞脱靶检测的方法


[0001]本专利技术涉及生物领域。具体地，本专利技术涉及基因编辑细胞脱靶检测的方法。

技术介绍

[0002]基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑或基因组工程，是能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术，基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。但是，基因编辑的一大挑战在于如何确保不会在DNA上的其他地方进行切割，即所谓的“脱靶效应”，其可能会产生不可预见的后果，这也严重制约了其推广应用。为了解决该难题，已有研究人员开发出了体外全基因组脱靶效应检测技术，例如Digenome
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seq、CIRCLE
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Seq、SITE
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Seq。但是这些检测技术仅能检测无细胞的基因组DNA，无法检测细胞内的脱靶效应。
[0003]为了检测细胞内脱靶效应，研究人员开发出了基于细胞的全基因组脱靶效应检测技术。例如，研究人员开发出的BLESS技术可以利用生物素标记细胞内的DSB，再结合二代测序进行脱靶效应检测；研究人员开发了GUIDE
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seq技术，可以在Cas9裂解区域引入短双链寡核苷酸标记脱靶断裂，再结合高通量测序找到脱靶位置；研究人员还开发出一种称为DISCOVER
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Seq的技术，该技术利用DNA修复因子染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法检测脱靶效应。但是，上述脱靶检测技术依然存在局限性，例如假阳性率高、灵敏度低(需要使用大量的细胞进行检测)、普适性低(每种方法都是为有限的编辑系统设计的，无法同时检测不同编辑工具的脱靶位点)，并且例如ABE、PE等基因编辑工具目前仍未开发出对应的体内细胞脱靶检测工具。
[0004]因此，目前针对基因编辑细胞脱靶检测方法仍有待研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。
[0006]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0007]大多数的基因编辑会造成DNA损伤，例如CRISPR/Cas9会导致双链DNA断裂(DSB)的产生，而单碱基编辑器(BE)及主编辑器(PE)会导致单链DNA断裂(SSB)的产生。若找到一种DSB和SSB共享的DNA结合因子，通过识别该因子与DNA的结合位点，进而确定基因编辑工具在基因组中切割的确切位置，便可以开发出一套适用于实现体内细胞编辑脱靶检测的技术。
[0008]有鉴于此，本专利技术的专利技术人进行深入研究分析，当细胞内存在DSB或SSB时，细胞内的核酸内切酶会切割DNA损伤处产生单链DNA区域，而细胞内存在能够与单链DNA相结合的蛋白，将与产生的单链DNA形成蛋白
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单链DNA复合物。由此，这类蛋白可以作为基因编辑的潜在检测靶点，提取出与该蛋白相结合的单链DNA，并进一步对单链DNA测序分析，从而可以确定脱靶信息，具有高准确性、高灵敏度和高普适性等特点，体内和体外细胞脱靶检测均实现，适于广泛应用。
[0009]为此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种基因编辑细胞脱靶检测的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：(1)对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白
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单链DNA复合物；(2)从所述基因编辑细胞中分离出单链DNA；(3)将所述单链DNA构建测序文库，对所述测序文库进行测序，获得测序结果；(4)将所述测序结果与参考序列进行比对分析，确定脱靶信息。
[0010]根据本专利技术实施例的方法中，利用细胞内存在能够与单链DNA相结合的蛋白这一特性，将其作为基因编辑的潜在检测靶点，提取出与该蛋白相结合的单链DNA，并进一步对单链DNA测序分析，从而可以确定脱靶信息，具有高灵敏度和高普适性等特点，体内和体外细胞脱靶检测均可实现，适于广泛应用。
[0011]根据本专利技术的实施例，上述基因编辑细胞脱靶检测的方法还可以具有下列附加技术特征：
[0012]根据本专利技术的实施例，所述蛋白选自复制蛋白A、RAD51蛋白或ATRIP蛋白。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述基因编辑细胞选自细胞系、原代细胞、免疫细胞、干细胞、体细胞或生殖细胞。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述基因编辑采用的基因编辑工具包括：TALEN、ZFN或者CRISPR系统介导的基因编辑器。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述基因编辑器选自CRISPR/Cas9基因编辑器、单碱基编辑器或者先导编辑器。
[0016]根据本专利技术的实施例，步骤(1)包括：将预先构建的用于基因编辑的载体转染至细胞中，培养细胞至预定时间后进行步骤(2)；其中，当采用CRISPR/Cas9基因编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为48～96小时；当采用单碱基编辑器或者先导编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为12～48小时。
[0017]根据本专利技术的实施例，步骤(2)包括：将含有所述基因编辑细胞的细胞液与刀豆蛋白A磁珠共孵育，去除上清，用含有所述蛋白的抗体的缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；用含有pA
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MNase的洗涤缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；用含有EDTA的缓冲液重悬磁珠，孵育，向试管中加入CaCl2溶液重悬磁珠，冰上消化，终止反应，离心，置于磁力架上，收集上清液；将所述上清液、蛋白酶K和载体RNA进行反应，得到反应液；从所述反应液中分离出单链DNA。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述重悬磁珠时，通过敲击试管以混匀。
[0019]根据本专利技术的实施例，将步骤(2)分离出的单链DNA进行步骤(3)的构建测序文库之前，采用HL
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dsDNase处理所述单链DNA，将所得处理物进行步骤(3)。
[0020]根据本专利技术的实施例，基于500个至100万个所述细胞获取的单链DNA，所述HL
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dsDNase的用量为1～5μL，所述处理包括：35～39℃孵育50分钟～70分钟，70～80℃孵育15～25分钟。
[0021]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种构建脱靶预测模型的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：针对细胞进行基因编辑，得到基因编辑细胞；利用前面所述基因编辑细胞脱靶检测的方法对所述基因编辑细胞进行不同基因编辑工具的脱靶检测，得到脱靶信息；将所述脱靶信息以及所述细胞的信息进行训练和测试，得到不同基因编辑工具针对所述细胞的脱靶预测模型。由此，利用根据本专利技术实施例的方法可以准确地构建脱靶预
测模型，可以针对不同基因编辑工具以及不同细胞类型，提供更为精准的sgRNA靶点设计参照。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述细胞的信息包括下列至少之一：细胞的类型、基因组信息、表观组学信息和转录组学信息。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述表观组学信息包括下列至少之一：染色质开放性信息、不同组蛋白修饰信息、甲基化信息和CTCF结合位点。
[0024]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑细胞脱靶检测的方法，其特征在于，包括：(1)对细胞进行基因编辑，获得的基因编辑细胞中含有蛋白
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单链DNA复合物；(2)从所述基因编辑细胞中分离出单链DNA；(3)将所述单链DNA构建测序文库，对所述测序文库进行测序，获得测序结果；(4)将所述测序结果与参考序列进行比对分析，确定脱靶信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白选自复制蛋白A、RAD51蛋白或ATRIP蛋白。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑细胞选自细胞系、原代细胞、免疫细胞、干细胞、体细胞或生殖细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑采用的基因编辑工具包括：TALEN、ZFN或者CRISPR系统介导的基因编辑器。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑器选自CRISPR/Cas9基因编辑器、单碱基编辑器或者先导编辑器。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：将预先构建的用于基因编辑的载体转染至细胞中，培养细胞至预定时间后进行步骤(2)；其中，当采用CRISPR/Cas9基因编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为48～96小时；当采用单碱基编辑器或者先导编辑器进行基因编辑时，所述预定时间为12～48小时。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将含有所述基因编辑细胞的细胞液与刀豆蛋白A磁珠共孵育，去除上清，用含有所述蛋白的抗体的缓冲液重悬磁珠，孵育，洗涤磁珠；用含有pA
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MNase的洗涤缓冲液重悬磁珠，孵育，洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱明，李寅青，蓝勋，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：