一种特异性引物对及其在鉴别宽体金线蛭中的应用制造技术

本发明专利技术涉及宽体金线蛭鉴别技术领域，具体涉及一种特异性引物对及其在鉴别宽体金线蛭中的应用，引物对包括引物对KT1

【技术实现步骤摘要】
一种特异性引物对及其在鉴别宽体金线蛭中的应用


[0001]本专利技术涉及宽体金线蛭鉴别
，具体涉及一种特异性引物对及其在鉴别宽体金线蛭中的应用。

技术介绍

[0002]水蛭：水蛭在我国用药历史悠久，常用于治疗多种淤血所致心脑血管疾病。据2020年版《中国药典》(一部)规定，药用水蛭为水蛭科动物蚂蝗(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蝗(尖细金线蛭)Whitmania acranulata Whitman的干燥全体。
[0003]目前市场中以宽体金线蛭为药用优良品种和市售药材主流品种。然而近年来随着含水蛭的中成药不断开发，水蛭的需求量增加，价格上涨，同时水蛭资源紧缺，来源混乱，存在着相似品种混淆用药、以次充好等问题。传统的水蛭鉴别方法是通过性状、薄层鉴别为主，但当药材加工、粉碎后，性状特征消失，使用传统的鉴别方法不能满足实际工作需求。随着分子生物学技术的发展，以DNA条形码为基础的动植物药材鉴别技术也日益完善，但DNA条形码技术需使用通用引物扩增，并将产物进行测序和序列比对，实验耗时长，仪器设备要求高，不适用于快速、高通量的检测应用。因此，需要设计基于扩增小片段基因的引物对，能够快速、准确的鉴定宽体金线蛭，减少水蛭中药材的掺假销售，保证药材的正品基源和质量控制，从而保证临床用药安全。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中无法快速、高通量检测鉴别宽体金线蛭的问题，本专利技术提供一种特异性引物对及其在鉴别宽体金线蛭中的应用，具有稳定性好、特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种特异性引物对，包括引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4；其中引物对KT1
‑
3上游引物序列如SEQ IDNO:1(5
’‑
GCACAGCCAGGAAGATTCC
‑3’
)所示，引物对KT1
‑
3下游引物序列如SEQ IDNO:2(5
’‑
CCTCAATTAAGGATGACCTAAGC
‑3’
)所示；引物对KT1
‑
4上游引物序列如SEQ IDNO:1(5
’‑
GCACAGCCAGGAAGATTCC
‑3’
)所示，引物对KT1
‑
4下游引物序列如SEQ IDNO:3(5
’‑
GGATAAAGGGTTCACCCTGC
‑3’
)所示。
[0006]第二方面，本专利技术提供一种所述特异性引物对在鉴别宽体金线蛭中的应用，即采用本专利技术所述引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4。
[0007]进一步的，鉴别宽体金线蛭的方法为，提取待鉴别样品基因组DNA，分别采用引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4对其进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小，引物对KT1
‑
3对扩增产物大小为235bp，引物对KT1
‑
4对扩增产物大小为266bp，当待测样品扩增产物出现上述条带时，即可判断出样品含有为宽体金线蛭或含有宽体金线蛭成分。
[0008]进一步的，PCR扩增时每25μl扩增体系中包括：Taq DNA聚合酶1U，10
×
PCR反应缓冲液(Mg
2+
plus)2.5μl，2.5mM dNTP溶液2μl，10μmolL
‑1上游引物0.5μl，10μmolL
‑1下游引物
0.5μl，DNA模板100ng，ddH2O补齐至25μl。
[0009]进一步的，PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。
[0010]进一步的，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测方法如下：称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50ml的0.5
×
TBE缓冲液，以微波炉加热至琼脂糖完全融化，加入5μl GelRed染料，将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，待其凝固后，取出置于电泳槽中，将PCR产物加入点样孔，电泳电压为100V，时间为50分钟，电泳结束后将凝胶放入凝胶成像仪中拍照观察。
[0011]进一步的，鉴别宽体金线蛭的方法具体包括如下步骤：
[0012](1)提取待鉴别样品基因组DNA，分别采用引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4对其进行PCR扩增，PCR扩增时每25μl扩增体系中包括Taq DNA聚合酶1U，10
×
PCR反应缓冲液(Mg
2+
plus)2.5μl，2.5mM dNTP溶液2μl，10μmolL
‑1上游引物0.5μl，10μmolL
‑1下游引物0.5μl，DNA模板100ng，ddH2O补齐至25μl；PCR扩增反应条件为，95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min；
[0013](2)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测方法如下：称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50ml的0.5
×
TBE缓冲液，以微波炉加热至琼脂糖完全融化，加入5μl GelRed染料，将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，待其凝固后，取出置于电泳槽中，将PCR产物加入点样孔，电泳电压为100V，时间为50分钟，电泳结束后将凝胶放入凝胶成像仪中拍照观察；
[0014](3)观察PCR产物条带大小，引物对KT1
‑
3对扩增产物大小为235bp，引物对KT1
‑
4对扩增产物大小为266bp，当待测样品扩增产物出现上述条带时，即可判断出样品含有宽体金线蛭或含有宽体金线蛭成分。
[0015]第三方面，本专利技术提供一种鉴定宽体金线蛭的试剂盒，试剂盒包括本专利技术所述的特异性引物对。
[0016]本专利技术的有益效果在于，采用本专利技术提供的引物对及方法进行鉴别试验，不受样品性状完整性影响，操作简单易行，只需提取样品基因组DNA，采用引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小，即可判断出样品是否为宽体金线蛭或含有宽体金线蛭成分，而不对其他水蛭品种产生非特异性反应，检测简便、准确。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]图1为本专利技术具体实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性引物对，其特征在于，包括引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4；其中引物对KT1
‑
3上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，引物对KT1
‑
3下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；引物对KT1
‑
4上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，引物对KT1
‑
4下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。2.一种权利要求1所述的特异性引物对在鉴别宽体金线蛭中的应用，其特征在于，采用权利要求1所述的引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4鉴别宽体金线蛭。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，鉴别宽体金线蛭的方法为，提取待鉴别样品基因组DNA，分别采用引物对KT1
‑
3或引物对KT1
‑
4对其进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带大小，引物对KT1
‑
3对扩增产物大小为235bp，引物对KT1
‑
4对扩增产物大小为266bp，当待测样品扩增产物出现上述条带时，即可判断出样品含有宽体金线蛭或含有宽体金线蛭成分。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增时每25μl扩增体系中包括：Taq DNA聚合酶1U，10
×
PCR反应缓冲液(Mg
2+
plus)2.5μl，2.5mM dNTP溶液2μl，10μmolL
‑1上游引物0.5μl，10μmolL
‑1下游引物0.5μl，DNA模板100ng，ddH2O补齐至25μl。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘爽，刘金花，田喜梅，刘桂银，闫庆康，李向，肖凯，杨东杰，胡坤盟，羿丹，
申请(专利权)人：山东康源堂中药饮片股份有限公司，
类型：发明
国别省市：