一种用于预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法。所述方法是以奥密克戎变体B.1.1.529变异株（GenBank:OW996240.1）的刺突蛋白S基因为对象，经过密码子优化，制备含有该优化基因的重组腺相关病毒，克服了新冠病毒S蛋白比较长，很难高表达的问题，且该疫苗具有免疫稳定、持久、安全等特点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法


[0001]本专利技术涉及疫苗生产领域，更具体地，涉及一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法。

技术介绍

[0002]2021年11月26日世界卫生组织（WHO）将新型严重急性呼吸道综合征冠状病毒（SARS
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CoV
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2）变异株B.1.1.529命名为奥密克戎（Omicron）—一种需要高度关注的变异株（variant of concern，VOC）。不论是病毒感染或疫苗接种产生抗体的主要靶标都是SARS
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CoV
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2的刺突（spike，S）蛋白，在S蛋白上有5个突变位点的德尔塔（Delta）突变株已经造成了全球范围的传播，而奥密克戎株在S蛋白上的突变位点高达30余个。因此奥密克戎变异株的出现，在世界范围内按下了“紧急按钮”，许多国家都颁布了旅行限制令，以防止奥密克戎株的迅速蔓延。
[0003]疫苗接种已被证明是预防和控制新冠病毒感染的最有效手段。目前已经有四种疫苗，即病毒灭活疫苗、病毒载体疫苗、DNA/RNA疫苗和蛋白疫苗。这些疫苗主要针对刺突蛋白。然而奥密克戎变异株出现的32个氨基酸的变化，包括3个小的基因缺失和1个小的基因插入，可能会极大地提高其逃避当前疫苗的能力。
[0004]考虑到B.1.1.529变异株在全球范围内广泛流行，本专利技术的目的就是提供一种针对新冠病毒B.1.1.529变异株的疫苗，以应对持续蔓延的变异株新冠疫情。

技术实现思路

[0005]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法。所述方法是以奥密克戎变体B.1.1.529变异株（GenBank:OW996240.1）刺突蛋白S基因为对象，经过密码子优化，制备含有该优化基因的重组腺相关病毒，克服了新冠病毒S蛋白比较长，很难高表达的问题，且该疫苗具有免疫稳定、持久、安全等特点。
[0006]本专利技术的目的之一是提供一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1）、目的基因获取：以新冠病毒B.1.1.529变异株的S基因（GenBank:OW996240.1）为模板，经密码子优化得到如SEQ ID NO.1所示的S基因序列；2）、穿梭质粒构建：以穿梭质粒作为模板，首先采用限制性内切酶进行酶切，然后用T4DNA连接酶将所述如SEQ ID NO.1所示DNA片段与穿梭质粒进行连接；将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，进行大量培养，并采用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒大量提取，测定质粒浓度，
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40℃保存备用；
3）、穿梭质粒与骨架质粒酶切及纯化：将步骤2）的穿梭质粒与骨架质粒用限制性内切酶进行单酶切，形成线性质粒；将线性化质粒通过酚
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氯仿
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异戊醇进行抽提纯化，并对纯化后质粒进行浓度测定；4）、穿梭质粒与骨架质粒共转染：将线性化的穿梭质粒与骨架质粒按照1:3（共2μg）的比例混合，共转染入宿主细胞，将质粒混合液与2μL转染试剂在500μL的opti
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MEM培养液混匀，将混合液室温静置30
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60min，然后将混合液加入到宿主细胞中，在37℃，5%CO2恒温箱中处理2h，并补加1.5mL2%FBS的DMEM培养液后，再继续培养10
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15天，直到出现CPE现象。将出现CPE细胞液继续接种至新的宿主细胞，稳定遗传20代次；5）、重组腺病毒增殖：在转染后10
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15天，宿主细胞出现CPE现象，将细胞在
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80℃反复冻融3次，收集到离心管中后，3000rpm，离心10min，收集上清液；向含有宿主细胞的六孔板中接种重组腺病毒，接种36
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48h后，再在
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80℃条件下进行冻融，收集病毒，即为：重组腺病毒基因疫苗。
[0007]优选地，步骤2）中的穿梭质粒为pac
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Ad
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shuttle CMV k
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npa质粒；优选地，步骤2）中的酶切体系为50μL，其包括：20μL质粒，4μLHandIII，5μL10
×
buffer，21μLddH2O；优选地，步骤2）中的连接体系为10μL，其包括：1μLT4DNA连接酶，3μLpac
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Ad
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shuttle CMV k
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npa质粒，5μL如SEQIDNO.1所示的DNA片段，1μL10
×
buffer；优选地，步骤3）中的骨架质粒为pacAd5
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9.2
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100；优选地，步骤3）中酶切体系为100μL，其包括：40μL质粒，4μLPacI，10μL10
×
buffer，46μLddH2O；优选地，步骤4
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5）中宿主细胞为HEK293；优选地，步骤4）中转染试剂为X
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tremeGENEHP；本专利技术的目的之二是提供一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗，所述疫苗是由上述工艺生产方法制备得到；本专利技术的目的之三是提供一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗在制备用于预防奥密克戎变体药剂中的用途，其特征在于，所述疫苗是由上述工艺生产方法制备得到；进一步优选地，本专利技术中的所述腺病毒载体可选自Ad1
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Ad52载体中的至少一种或者为缺失E1和E3区基因的复制缺陷型载体。
[0008]进一步优选地，所述重组腺病毒基因疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。可以根据具体的需要选择适合的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
[0009]进一步优选地，所述腺病毒载体疫苗的剂型包括但不限于口服剂、注射剂、气雾吸入剂等常见的疫苗剂型。在一些实例中，所述腺病毒载体疫苗还可以和其他药物联用。在一些实例中，所述疫苗还包括至少一种对COVID
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19有预防和/或治疗作用的药物。
[0010]本专利技术的优点如下：1）由于奥密克戎变体B.1.1.529变异株原始的S基因序列蛋白不能有效在细胞内高效表达，我们采用密码子偏好性进行优化得到新的S基因序列，其能高效在人源细胞内高
效表达，免疫机体后可高效表达S蛋白。
[0011]2）优化的序列在人体或人源性细胞内表达后，可诱导产生较高滴度的针对奥密克戎株的中和抗体，可以有效保护机体免受奥密克戎株的侵染，发挥多重保护作用。
附图说明
[0012]图1：重组腺病毒载体疫苗S蛋白相对表达量；图2：重组腺病毒载体疫苗中和抗体检测。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0014]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，并不用来限制本专利技术的范本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预防奥密克戎变体的重组腺病毒基因疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1）、目的基因获取：以新冠病毒B.1.1.529变异株的S基因GenBank:OW996240.1为模板，经密码子优化得到如SEQ ID NO.1所示的S基因序列；2）、穿梭质粒构建：以穿梭质粒作为模板，首先采用限制性内切酶进行酶切，然后用T4 DNA连接酶将如SEQ ID NO.1所示DNA片段与穿梭质粒进行连接；将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，进行大量培养，并采用无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒大量提取，测定质粒浓度，
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40℃保存备用；3）、穿梭质粒与骨架质粒酶切及纯化：将步骤2）的穿梭质粒与骨架质粒用限制性内切酶进行单酶切，形成线性质粒；将线性化质粒通过酚
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氯仿
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异戊醇进行抽提纯化，并对纯化后质粒进行浓度测定；4）、穿梭质粒与骨架质粒共转染：将线性化的穿梭质粒与骨架质粒按照1:3的比例混合，共转染入宿主细胞，将质粒混合液与2μL转染试剂在500μL的opti
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MEM培养液混匀，将混合液室温静置30
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60min，然后将混合液加入到宿主细胞中，在37℃，5%CO2恒温箱中处理2h，并补加1.5mL2%FBS的DMEM培养液后，再继续培养10
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15天，直到出现CPE现象；将出现CPE细胞液继续接种至新的宿主细胞，稳定遗传20代次；5）、重组腺病毒增殖：在转染后10
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15天，宿主细胞出现CPE现象，将细胞在
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80℃反复冻融3次，收集到离心管中后，3000rpm，离心10min，收集上清液；向含有宿主细胞的六孔板中接种重组腺病毒，接种36
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48h后，再在
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80℃条件下进行冻融，收集病毒，即为：重组腺病毒基因疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中的穿梭质...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡春凌，蒋英丽，彭姣，
申请(专利权)人：深圳源兴基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：