一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒，包括样本前处理试剂，所述的前处理试剂中包括：水、使用浓度为60%

【技术实现步骤摘要】
一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于疾病诊断试剂盒领域，具体涉及一种用于人血清和血浆中全谱脂溶性维生素及其代谢物检测的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]维生素是维持人和动物正常生理功能的重要物质，这类物质必须从食物中获得，在人类的生长发育和代谢中发挥着重要的作用。维生素分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类，其中脂溶性维生素主要包括维生素A(VA)、维生素D(VD)、维生素E(VE)和维生素K(VK)等。
[0003]维生素A与视力、生长发育、免疫系统相关，缺乏维生素A会引起夜盲症，干眼症，皮肤病，免疫功能低下，儿童生长发育迟缓等；维生素D是一种脂溶性维生素，主要由维生素D2、维生素D3两种活性成分组成，维生素D在肝脏内被转化为25
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羟基维生素D，临床上以25
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羟基维生素D作为评价体内维生素D营养水平的指标；维生素E是重要的生物氧化剂，缺乏维生素E会引起贫血、免疫低下、神经系统退行性病变。维生素K参与凝血因子的合成和骨骼中钙磷代谢。因此，脂溶性维生素的检测可评估患者体内的脂溶性维生素的营养状况。对脂溶性维生素缺乏或过量的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。
[0004]脂溶性维生素的传统检测方法有比色法、紫外失活分光光度法、荧光法及微生物法等。这些方法只能测定某一种维生素的含量，操作步骤复杂，血样样本量大，且结果不稳定，干扰因素多，因此需要建立一种灵敏、准确、快速的分析方法。
>[0005]申请号为CN202110241142.7的中国专利中公开了：一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法。该专利技术提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血清中脂溶性维生素的样品前处理方法，通过采用特定的蛋白沉淀剂，并与内标准品工作液混合成内标溶液，从而简单高效地完成样品前处理，无需任何额外的样品富集等操作，即可显著提高血清样品中脂溶性维生素A、E、K1、K2的回收率，降低样品前处理的成本，从而大幅提升血清中脂溶性维生素检测的灵敏度，并能保证检测结果的准确性和稳定性。但是由于前处理方法过于简单，并且K1、K2在血清中浓度很低，该专利中未体现各项目的定量下限，数据不够完整，缺乏可信度。
[0006]申请号为CN202011615598.7的中国专利中公开了：用于检测脂溶性维生素的试剂盒和检测方法，该试剂盒包括：至少三瓶脂溶性维生素校准品、至少三瓶脂溶性维生素质控品、混合内标蛋白沉淀剂、流动相添加剂以及提取液；脂溶性维生素包括维生素A、维生素E、25
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羟基维生素D2、25
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羟基维生素D3、维生素K1和维生素K2；混合内标蛋白沉淀剂包括含有蛋白沉淀剂、维生素A
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d3内标物、维生素E
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d6内标物、25
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羟基维生素D2
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d3内标物、25
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羟基维生素D3
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d6内标物、维生素K1
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d7内标物和维生素K2
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d7内标物的混合溶液；流动相添加剂包括含有甲酸的甲醇溶液以及含有甲酸的乙腈溶液。该专利技术能够同时检测多种脂溶性维生素，但是标准曲线需要结合质控品确定准确性问题，并且需要确定标准曲线方程的斜率和
截距是否分别在预设的范围内，可行之后再移取上清液进行实验，方法较为复杂，并且耗时较长，容易引起较大实验误差，不利于样本准确检测。
[0007]开发操作更简单、效率更高、结果更准确、灵敏度更高的脂溶性维生素检测试剂盒和检测方法十分必要。

技术实现思路

[0008]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种从血清/血浆样本中有效提取5项脂溶性维生素类的前处理试剂盒。试剂盒配合使用液相色谱串联质谱（LC
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MS/MS）法测定血清/血浆样本中脂溶性维生素：维生素A（VitaminA, VA）维生素E（VitaminE, V E）、25
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羟基维生素D2（25（OH）VD2, VD2）和25
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羟基维生素D3（25（OH）VD3, VD3），维生素K1（VitaminK1, VK1），血清/血浆样本使用前处理试剂盒处理后取上清进样。在电喷雾电离模式下，采用多反应监测模式（MRM）检测，最后使用内标法进行准确定量分析。本专利技术用液相色谱串联质谱技术检测脂溶性维生素，前处理使用SPE板净化的方法，方法简单，效率极高，优势突出。具体地，该试剂盒能够有效的提取脂溶性维生素类，使用液质联用的方法能够提供高分辨率，高特异性以及高灵敏度的检测，前处理方法避免冻干过程，避免衍生化，前处理方法简单，耗时短，可以有效的提高检测通量。
[0009]本专利技术中，“MTBE”指甲基叔丁基醚，是一种有机化合物，化学式为C5H
12
O，为无色透明液体，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚。
[0010]本专利技术中，“SPE板”指固相萃取板，是从层析柱发展而来的一种用于萃取、分离、浓缩的样品前处理装置。SPE技术基于液
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固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、净化，是一种包括液相和固相物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。
[0011]本专利技术中，所涉及用量比时，“V”表示体积，单位为升（L）；“m”表示质量，单位为克（g）；“n”表示物质的量，单位为摩尔（mol）。
[0012]本专利技术中，“淋洗液”的作用在于清洗上样后残留在固相萃取板的杂质，确保洗脱过程更加干净。
[0013]本专利技术中，“洗脱液”的作用在于将目标物从固相萃取板洗脱。
[0014]本专利技术中，“样品”和“样本”具有同样的含义。
[0015]一方面，本专利技术提供了一种血液样本前处理方法。
[0016]具体地，所述的前处理方法中包括：依次使用水和60%
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80%（V/V）的甲醇水溶液对固相萃取板上的样品进行淋洗；吹干柱床后再用甲基叔丁基醚对样品进行洗脱；洗脱液吹干后使用甲醇复溶。
[0017]优选地，所述的甲醇水溶液为70%（V/V）甲醇水溶液。
[0018]具体地，所述的水和甲醇的用量比为1：1（V/V）。
[0019]优选地，所述的吹干柱床的具体操作为：真空度10
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15mmHg吹1
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3min；进一步优选为2min。
[0020]优选地，所述的洗脱液吹干采用氮吹仪吹干，具体条件为室温吹干，吹干时间以样本干燥状态为准，可以是10
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20min，一般为15min。
[0021]优选地，所述的甲醇复溶后还包括混匀步骤，可以是高速旋涡混匀；所述的混匀步
骤后还可以包括离心步骤，所述的离心为高速离心，高速离心条件为10000
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14000rpm离心3
‑
8min，在一些本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血液样本前处理方法，其特征在于，包括：依次使用水和60%
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80%V/V的甲醇水溶液对SPE板上的样品进行淋洗；吹干柱床后再用甲基叔丁基醚对样品进行洗脱；洗脱液吹干后使用甲醇复溶。2.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的水和甲醇的用量体积比为1：1。3.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的吹干柱床的具体操作为：真空度10
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15mmHg吹1
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3min。4.根据权利要求1所述的血液样本前处理方法，其特征在于，所述的固相萃取板包括甲醇和超纯水预处理步骤，所述的甲醇和超纯水的用量体积比1：1。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的血液样本前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）吸取300
µ
L血液样品至EP管中；（2）加入60
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80
µ
L混合内标工作液；涡旋混合1min后并高速离心分离20s；（3）然后分别在（2）的样本中加入750
‑
900
µ
L乙腈，涡旋5min；高速离心5min；（4）依次使用甲醇和超纯水预处理固相萃取板；（5）从（3）离心好的样本中取0.8
‑
1.0 mL上清液至（4）预处理后的固相萃取板中；（6）依次使用超纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵妍，陈怡昭，王春燕，孙美珊，冯涛，邹浩，
申请(专利权)人：苏州颐坤生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：