本发明专利技术公开一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，属于生物技术领域。该方法结合了MMC和SFC两种适应性实验室进化方式，以甲醇作为筛选压力，来驱动毕赤酵母GS115菌株增加其对高甲醇的耐受性和利用率。该进化菌株的优良特性使其具有非常良好的工业应用前景，可广泛用于利用廉价甲醇碳源生产酶制剂和高值化学品，也为非灭菌型发酵生产提供可能性。此两种适应性结合的进化方法可以被应用于其他菌株的不同耐受条件的进化，并且大幅缩短进化周期，提高菌株耐受性。提高菌株耐受性。提高菌株耐受性。
【技术实现步骤摘要】
一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，并根据该方法得到一株耐高甲醇浓度的毕赤酵母。
技术介绍
[0002]巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii，K. phaffii）（简称毕赤酵母）是一种典型的甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源和能源，因其拥有较成熟的蛋白分泌表达系统，成为受欢迎的微生物细胞工厂。但其对甲醇的利用率与同化效率不理想，甲醇及有毒代谢中间产物的积累对细胞具有毒性，不利于菌体生长和重组蛋白的大量生成。因此开发能够高效耐受甲醇的毕赤酵母菌株显得尤为重要。
[0003]适应性实验室进化又称定向进化、实验室进化，是利用微生物固有的“生物鲁棒性”，即特定的压力条件下，适应环境的正突变生物体能获得后代数量优势（如菌体生长速度，底物消耗速度，耐受高温、高或低pH值以及不同有机溶剂等），通过连续传代培养获得数量富集，在此基础上产生新的基因正突变以获得质量富集。长时间处于高甲醇浓度下的微生物会产生一系列基因型的变化来响应甲醇胁迫压力，从而得到能耐受不利的生长环境的微生物菌株。
[0004]常用的适应性实验室进化就是在摇瓶中通过连续培养法（Shake Flask Culture，SFC）实现进化，进化的速度取决于基因突变率和筛选条件，但是自然突变率通常很低，导致许多进化周期较长，从几个月甚至数年不等，进化时间越长，传代培养过程越容易染菌，从而引起进化失败。最近在提高菌株甲醇耐受的研究中，朱泰承等人的专利通过摇瓶驯化的毕赤酵母菌株的比生长速率与出发菌株GS115相比至多提升1.95倍，在固体培养基中可耐受50g/L以上的甲醇，而毕赤酵母出发菌株GS115仅能耐受至多20g/L（相当于2.67%）的甲醇；Yamada等人通过多拷贝乳酸脱氢酶在毕赤酵母中表达，可以用4%甲醇为碳源在分批补料发酵；Guo等人通过代谢工程手段修饰毕赤酵母，可以用2%甲醇为碳源在摇瓶中发酵。然而目前毕赤酵母菌株甲醇耐受能力还有待进一步的加强。
[0005]全自动高通量微生物液滴培养系统（Microbial Microdroplet Culture system，MMC）是基于液滴微流控技术研发而成的一款微生物培养系统。MMC是适应性实验室进化的方式之一，具有高通量、自动传代、化学因子梯度添加、在线检测液滴光谱、微生物分选等功能，具有很好的微生物高效培养与筛选的功能。MMC有着超高通量、高灵敏度、定量准确性等优点，极大加速了具有特定功能微生物的筛选速度。在最近的研究中，Yun等人用MMC进化，用了30天时间提高Clostridium butyricum对100 g/L的1，3
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丙二醇耐受。目前并没有相关研究将MMC应用于毕赤酵母甲醇耐受相关研究的先例。然而MMC进化存在极限，即菌株在到达一定的耐受极限时很难继续进化。如何去突破菌株进化的极限是目前的研究方向之一。
技术实现思路
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种提高毕赤酵母
菌株耐高甲醇能力的方法。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一株耐高甲醇浓度的毕赤酵母菌株。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供上述方法或毕赤酵母菌株的应用。
[0009]本专利技术以GS115菌株为出发菌株，通过甲醇介导的MMC和SFC两种实验室适应性进化方式获得的高甲醇耐受的毕赤酵母突变菌株，来提高毕赤酵母对于甲醇的耐受能力及其在实际应用中的价值。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，包括如下步骤：使用MMC和SFC两种适应性实验室进化的方式：首先使用MMC，以不同浓度甲醇为唯一碳源的液体培养基，对毕赤酵母进行进化，得到能够在3～6%甲醇浓度条件下生长的毕赤酵母菌株；然后通过SFC对获得的毕赤酵母菌株进一步进化，最终可以在短时间内得到可以在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。
[0011]优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母（Komagataella phaffii，K. phaffii）GS115，但不限于此。
[0012]具体包括如下步骤：1）活化：将毕赤酵母（K. phaffii）进行活化，离心后收集菌体并弃上清，洗涤菌体两次后，将菌体接种在甲醇为碳源的液体培养基中进行培养，待菌株进入稳定期后用做MMC进化中的种子液；2）MMC进化：首先将步骤1）获得的种子液传代于0.1～1.0%甲醇浓度的液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的液体培养基，连续传代近15～30次，MMC进化所需总时间为300～500h；3）筛选：将长势较好的液滴筛选出来，划线，挑取单菌落在含有4%～6%甲醇浓度的液体培养基中进行摇瓶/平板发酵验证，筛选出能高效耐受甲醇的优良菌株，继续进行SFC进化；4）SFC进化：将MMC筛选到的优良菌株首先在含有0.1～1%甲醇浓度的液体培养基中活化培养（培养48～72h），然后转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中进行培养一定时间（初始OD
600
为0.1～2，培养24～96h）；如果在一定时间（24～96h）内OD
600
达到8～15，进化菌株转移到含有下一个甲醇浓度的液体培养基中继续培养（初始OD
600
为0.1～2）；如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养；通过SFC进化共300～500h后，获得在8～20%（优选10～13%）甲醇浓度条件下正常生长的菌株。
[0013]进一步的，步骤1）中：所述的活化为将毕赤酵母（K. phaffii）在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）固体培养基平板上挑取单菌落接种至YPD液体培养基中活化培养；其中，活化培养的时间为48h～72h（优选72h）；所述的洗涤为用无菌生理盐水洗涤；所述的甲醇为碳源的液体培养基为含有0.1～1%（v/v）甲醇浓度的液体培养基；优选为含有0.1～1%（v/v）甲醇浓度的BMMY液体培养基；所述的1%（v/v）浓度甲醇等于7.5 g/L甲醇。
[0014]进一步的，步骤2）中：
将种子液装入MMC的进样小瓶中（0.1 OD左右的种子液与油相），另外两个进样小瓶分别装入纯甲醇与油相和0.1～1%甲醇浓度的BMMY液体培养基与油相。
[0015]所述的液体培养基均为BMMY液体培养基；进一步的，步骤3）中：所述的划线是在YPD平板上划线；所述的液体培养基为BMMY液体培养基；步骤3）筛选出的优良菌株可以在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中正常生长的菌株（OD
600
=5～8）。
[0016]步骤4）中所述的液体培养基为BMMY液体培养基；步骤4）中，转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基，优选的，进化甲醇浓度间隔为2%；步骤4）中，SFC进化后获得的菌株在6%甲醇浓度的BMMY液体培养基中发酵36～48h生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高毕赤酵母菌株耐高甲醇能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：使用MMC和SFC两种适应性实验室进化的方式对毕赤酵母：首先使用MMC，以不同浓度甲醇为唯一碳源的液体培养基，对毕赤酵母进行进化，得到能够在3～6%甲醇浓度条件下生长的毕赤酵母菌株；然后通过SFC对获得的毕赤酵母菌株进一步进化，最终能在短时间内得到在8～20%甲醇浓度条件下正常生长的菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毕赤酵母为毕赤酵母（Komagataellaphaffii）GS115。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）活化：将毕赤酵母进行活化，离心后收集菌体并弃上清，洗涤菌体两次后，将菌体接种在甲醇为碳源的液体培养基中进行培养，待菌株进入稳定期后用做MMC进化中的种子液；2）MMC进化：首先将步骤1）获得的种子液传代于0.1～1.0%甲醇浓度的液体培养基中，富集培养一定时间后，再依次传代于2.0%～5.0%甲醇浓度的液体培养基，连续传代15～30次，MMC进化所需总时间为300～500h；3）筛选：将长势较好的液滴筛选出来，划线，挑取单菌落在含有4%～6%甲醇浓度的液体培养基中进行摇瓶/平板发酵验证，筛选出能高效耐受甲醇的优良菌株，继续进行SFC进化；4）SFC进化：将MMC筛选到的优良菌株首先在含有0.1～1%甲醇浓度的液体培养基中活化培养，然后转移到含有4～10%甲醇浓度的液体培养基中进行培养一定时间；如果在一定时间内OD
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达到8～15，进化菌株转移到含有下一个甲醇浓度的液体培养基中继续培养；如果没有，则将菌株转移到甲醇浓度相同培养基中继续培养；通过SFC进化共300～500h后，获...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩双艳，王帅，赵风光，林影，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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