缺陷干扰病毒基因组制造技术

产生缺陷干扰病毒基因组(DVG)的方法、包含所述DVG的缺陷干扰粒子及其方法和用途。含所述DVG的缺陷干扰粒子及其方法和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】缺陷干扰病毒基因组
本专利技术的一部分是在美国政府的支持下，根据国防高级研究计划局(Defense Advanced Research Projects Agency，DARPA)批准的第HR0011
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0023号协议完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。引言
[0001]本专利技术是在美国政府的支持下，根据国防高级研究计划局(DARPA)批准的DARPA协议号HR00111720023完成的。具有RNA基因组的病毒具有固有高错误率的聚合酶。由于这种容易出错的复制过程，这些病毒不仅会生成全长病毒基因组或具有点突变的基因组，而且还会生成有缺陷的基因组。已经描述了多种类型的缺陷基因组，包括截断(truncation)、插入、缺失、嵌合(mosaic)或重排的基因组和写回(copyback)/回转(snapback)。虽然大多数缺陷基因组被认为是RNA病毒复制的死端副产物，但这些缺陷病毒基因组(defective viral genome，DVG)的一个子集会干扰感染性子代病毒颗粒生成较高数目。
[0002]除高突变率外，重组是RNA病毒进化的另一个主要驱动力。非同源重组可产生构成缺陷病毒基因组(DVG)的截断和/或重排的病毒基因组。1954年，Von Magnus在甲型流感病毒中首次描述了DVG，此后所有病毒家族中都描述了DVG。由于缺乏部分基因组或其编码功能，DVG必须与其亲代病毒共同感染细胞，以利用全长病毒编码的蛋白质。因此，劫持复制机制或使用亲代病毒编码的蛋白质的DVG可与野生型病毒竞争资源，从而抑制亲代病毒。这些类型的DVG通常被称为缺陷干扰粒子(defective interfering particle，DIP)。此外，许多DVG在哺乳动物和无脊椎动物中都具有强大的免疫刺激潜力。在急性登革热病毒感染患者的血清中发现了DVG，但它们的病理生理作用尚不清楚。在人类中，它们的存在与流感病毒和呼吸道合胞病毒感染的轻型疾病和更好的治疗结果相关。所有这些原因都解释了人们重新燃起的对使用DVG作为抗病毒疗法的兴趣。
[0003]虽然已记载了DVG存在于大多数病毒中，但在许多病毒家族中，DVG并不被认为是相关的或占主导地位的。通常，对于任何给定的病毒，仅记载了少许DVG。这些先前的报告依赖于更经典的分离方法，例如PCR扩增，其仅选择一种或两种DVG，并偏向于最短或最丰富的DVG。就与野生型病毒竞争的能力而言，这些DVG不一定是最佳候选。因此，需要可复制且合理的方法来识别和生成最佳的DVG候选，以与野生型病毒感染竞争并对其进行干扰，该方法可用于任何感兴趣的病毒，尤其是人类病原体。本文公开的专利技术满足这些及其他需要。
[0004]我们组合的实验进化和计算方法识别了任何病毒的数千种不同的DVG。首先，我们的实验方法在病毒种群中生成所有可能的DVG。不出所料，我们的列表中包括类似于更经典方法所识别的DVG。其次，我们的计算分析使我们能够使用从序列数据估计的时间频率来预测哪些DVG作为缺陷干扰粒子的效果最好。使用这种组合方法，我们为属于不同病毒家族的多种病毒生成了最佳候选列表，其中最高达90％的病毒已证实具有干扰野生型病毒复制的能力。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了生成DVG的方法，还提供了由所述方法生成的新DVG。提供了由基孔
肯雅病毒(chikungunya virus，CHIKV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)、西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)、黄热病病毒(yellow fever virus YFV)和鼻病毒(rhinovirus，RV)以及冠状病毒(coronavirus CV)(例如，最近发现的名为SARS
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CoV
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2、2019
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nCov或COVID
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19的新型冠状病毒)生成的DVG。
[0006]专利技术人已经使用新一代测序方法识别了DVG，随后进行了计算分析、热点分析识别了多种为缺失DVG(CHIKV、EV71、ZIKV以及RV病毒基因组的内部缺失)的DVG。随后，对这些DVG进行了基因改造，并测试了其降低CHIKV、EV71、ZIKV和RV的传染性病毒滴度的能力。成功的DVG候选有可能被用作治疗性干扰粒子(therapeutic interfering particle，TIP)，其可用作一种治疗和限制病毒感染严重程度的新策略。此外，还识别了WNV和YFV的DVG。基于其他病毒的成功，这些DVG有可能用作TIP。
[0007]在第一方面，提供了一种用于产生缺陷干扰病毒基因组(DVG)的方法。该方法包括：提供第一组至少三种复制的体外细胞培养物，所述培养物包含固体载体和以高感染复数(multiplicity of infection，MOI)感染参照感染性病毒的细胞；提供第二组至少三种复制的体外细胞培养物，所述培养物包含固体载体和以低感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；在正常生长条件下，将第一组和第二组复制的体外细胞培养物培养至少5代；从第一组和第二组体外复制的细胞培养物的培养基中收集多种DVG候选；对收集的DVG候选进行深度测序；从多种DVG候选中选择一个DVG的子集。
[0008]在一些实施方案中，该方法还包括提供第三组至少三种复制的体外细胞培养物，所述培养物包含固体载体和以高感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；和/或提供第四组至少三种复制的体外细胞培养物，所述培养物包含固体载体和以低感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；和在诱变条件下，将第三组和/或第四组复制的体外细胞培养物培养至少5代；或使用具有增变基因表型(mutator phenotype)的参照感染性病毒进行所述传代。
[0009]在一些实施方案中，从多种DVG候选中选择一种DVG包括：将DVG候选的序列与参照感染性病毒的基因组序列进行比较；识别具有包含至少一个剪接事件(splicing event)的基因组的至少一种DVG候选，其中所述剪接事件是缺失或重排；确定在已测序的DVG候选基因组群中具有包含至少一个剪接事件的基因组的至少一种DVG候选的相对频率；并且，选择至少一种DVG，其中：a)至少一个剪接事件在高MOI培养物中比在低MOI培养物中更丰富；和/或b)至少一个剪接事件出现在至少2、3、4、5、6、7、8或9个不同的细胞系中；和/或，c)在至少5、10、15或20次传代后，在至少12、24或36次独立复制的至少3次中发现至少一个剪接事件；和/或，d)至少一个剪接事件是缺失事件，并且缺失的核苷酸大小是至少40、42、50、100、150、200、400、600或1000个核苷酸；和/或，e)保留该DVG中的开放阅读框；和/或，f)病毒复制所需的结构域和功能保留在该DVG中；和/或g)该DVG包含至少一种降低参照感染性病毒的自我复制能力的突变。
[0010]在一些实施方案中，DVG的特征本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生缺陷干扰病毒基因组(DVG)的方法，所述方法包括：提供第一组至少三种复制的体外细胞培养物，其包含固体载体和以高感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；提供第二组至少三种复制的体外细胞培养物，其包含固体载体和以低感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；在诱变条件下，将第一组和第二组复制的体外细胞培养物培养至少5代；从第一组和第二组体外复制的细胞培养物的培养基中收集多种DVG候选；对所收集的DVG候选进行深度测序；和从所述多种DVG候选中选择DVG。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：提供第三组至少三种复制的体外细胞培养物，其包含固体载体和以高感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；和/或提供第四组至少三种复制的体外细胞培养物，其包含固体载体和以低感染复数(MOI)感染参照感染性病毒的细胞；和在非诱变条件下，将第三组和/或第四组复制的体外细胞培养物培养至少5代。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，从所述多种DVG候选中选择DVG包括：将所述DVG候选的序列与所述参照感染性病毒的基因组序列进行比较；识别具有包含至少一个剪接事件的基因组的至少一种DVG候选，其中所述剪接事件是缺失或重排；在已测序的DVG候选基因组群中确定具有至少一个剪接事件的基因组的至少一种DVG候选的相对频率；和，选择至少一种DVG，其中：a)至少一个剪接事件在高MOI培养物中比在低MOI培养物中更丰富；和/或b)至少一个剪接事件出现在至少2、3、4、5、6、7、8或9种不同的细胞系中；和/或，c)在至少5、10、15或20次传代后，在至少12、24或36次独立复制的至少3次中发现至少一个剪接事件；和/或，d)至少一个剪接事件是缺失事件，并且所述缺失的核苷酸大小是至少40、42、50、100、150、200、400、600或1000个核苷酸；和/或，e)保持所述DVG中的开放阅读框；和/或，f)病毒复制所需的结构域和功能在所述DVG中保持；和/或g)所述DVG包含至少一种降低所述参照感染性病毒自我复制能力的突变。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述DVG的特征在于对所述参照感染性病毒的体外抑制活性为至少50％、60％、70％、80％或90％。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述参照感染性病毒具有增变基因表型。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述参照感染性病毒为基孔肯雅病毒(CHIKV)、寨卡病毒(ZIKV)、肠道病毒71型(EV71)、鼻病毒(RV)、黄热病病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)或冠状病毒(CV)。7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述参照感染性病毒选自由以下组
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CoV
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CoV
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2DVG_3)，或与这些序列之一具有至少70％同一性、更优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、更优选至少91％同一性、更优选至少92％同一性、更优选至少93％同一性、更优选至少94％同一性、更优选至少95％同一性、更优选至少96％同一性、更优选至少97％同一性、更优选至少98％同一性、或更优选至少99％同一性的核苷酸序列。14.一种缺陷干扰粒子，所述缺陷干扰粒子包含权利要求12或13所述的DVG。15.一种治疗受试者病毒感染的方法，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种根据权利要求12至14中任一项所述的DVG或缺陷干扰粒子。16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述DVG作为裸RNA施用。17.根据权利要求15所述的方法，其中，至少一种DVG是缺陷干扰CHIKV基因组。18.根据权利要求17所述的方法，其中，至少一种缺陷干扰CHIKV基因组包含选自由以下组成的组的核苷酸序列或由选自由以下组成的组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：34(CHIKV DVG
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TIP
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TIP
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20)。25.根据权利要求15所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰基因组是缺陷干扰YFV基因组。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰YFV基因组包含选自由以下组成的组的核苷酸序列或由选自由以下组成的组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：93(YFV DVG
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L)。27.根据权利要求15所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰基因组是缺陷干扰WNV基因组。28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰WNV基因组包含选自由以下组成的组的核苷酸序列或由选自由以下组成的组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO:105(WNV DVG
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6)。29.根据权利要求15所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰基因组是缺陷干扰CV基因组。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述至少一种缺陷干扰CV基因组包含选自由以下组成的组的核苷酸序列或由选自由以下组成的组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：111(SARS
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CoV
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CoV
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CoV
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2DVG_3)。31.根据权利要求12至14中任一项所述的缺陷干扰基因组DVG或缺陷干扰粒子用于治疗受试者CHIKV感染的方法，特别是其中，所述缺陷干扰基因组包含选自由以下组成的组的核苷酸序列或由选自由以下组成的组的核苷酸序列组成：SEQ ID NO：34(CHIKV DVG
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【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：